Anticuerpos monoclonales para el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2.

Un anticuerpo monoclonal (mAb) que se une al receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGFR2),

en donde el mAb comprende tres CDR de la cadena ligera que tienen las secuencias de aminoácidos KASQGVSNDVA (CDR-L1), SASYRYT (CDR-L2) y QQHSTTPYT (CDR-L3) respectivamente; y tres CDR de la cadena pesada que tienen las secuencias de aminoácidos TYNVH (CDR-H1), SIYPDNGDTSYNQNFKG (CDR-H2) y GDFAY (CDR-H3) respectivamente.

Anticuerpos monoclonales para el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2 Declaración de interés del gobierno

La invención descrita en esta solicitud se realizó en parte con fondos proporcionados por Grant 5R44 CA11283-3 de los Institutos Nacionales de Salud. El Gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre esta invención.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la combinación de las tecnologías de anticuerpos monoclonales (mAb) y de ADN recombinante para el desarrollo de nuevos agentes biológicos, y más concretamente, por ejemplo, a la producción de anticuerpos monoclonales que se unen a, y neutralizan el Receptor del Factor de Crecimiento de Fibroblastos 2.

Antecedentes de la invención

Existen 22 miembros conocidos de la familia del Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGF), con un tamaño que oscila de 17 a 34 kDa y que comparten una región núcleo interna de similitud, que se pueden agrupar en 7 subfamilias basándose en su similitud de actividad y de secuencia (Ornitz et al., Genome Biol. 2:35.1, 21). Por ejemplo, el subgrupo FGF1 consiste en los FGF prototípicos, FGF1 (FGF ácido) y FGF2 (FGF básico); el subgrupo FGF4 consiste en FGF4, FGF5 y FGF6; y la subfamilia FGF7 consiste en FGF3, FGF7, FGF1 y FGF22 (Zhang et al., J. Biol. Chem. 281:15694, 26).

Una forma de FGF2 es un polipéptido no glicosilado de 18 kDa que consiste en 146 aminoácidos derivados de un precursor de 155 aa (Ornitz et al., Genome Biol. 2:35.1,21; Okada-Ban et al., Int. J. Biochem. Cell. Biol. 32:263, 2). Una secuencia ilustrativa para un FGF2 de 46 aminoácidos humano se proporciona en el SEQ ID NO: 4 del documento US2211563. A diferencia de la mayoría de los otros FGF, el FGF2 no codifica una secuencia señal para la secreción, sino que la forma de 18 kDa puede ser secretada mediante una ruta dependiente de la energía no convencional independiente del complejo RE-Golgi. El otro miembro de la subfamilia FGF1, el propio FGF1, tiene un tamaño y una estructura similares a los de FGF2 y también carece de secuencia señal pero puede ser secretado. Otro FGF de interés aquí es FGF7, también denominado factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), que es producido por las células de origen mesenquimal y estimula la proliferación de células epiteliales (Finch et al., Adv. Cáncer Res. 91:69, 24; Finch et al., J. Nati. Cáncer Inst. 98:812, 26). El KGF es expresado en numerosos órganos incluyendo pulmón, próstata, mama, tracto digestivo y piel y está implicado en el desarrollo de los órganos y en la reparación de las heridas cutáneas (Cho et al., Am. J. Pathol. 17:1964, 27).

Los miembros de la familia de FGF se unen solamente a cuatro receptores de tirosina quinasa conocidos, los Receptores del Factor de Crecimiento de Fibroblastos 1-4 (FGFR1-4) y sus isoformas, uniéndose los diversos FGF a diferentes FGFR en grados variables (Zhang et al., J. Biol. Chem. 281:15694, 26). Se proporciona una secuencia de proteína de FGFR2 humano, p. ej., en GenBank Locus AF487553. Cada FGFR consiste en un dominio extracelular (ECD) que comprende tres dominios de tipo inmunoglobulina (Ig) (D1, D2 y D3), una única hélice transmembrana, y un dominio quinasa catalítico intracelular (Mohammadi et al., Cytokine Growth Factor Revs, 16:17, 25) como se ilustra en la Fig. 1. Existe un tramo continuo de aminoácidos ácidos en el conector entre D1 y D2 denominado "caja ácida" (AB). Se cree que la región que contiene D1 y AB está implicada en la autoinhibición del receptor, que se libera mediante la unión al ligando. Los FGFR se caracterizan por múltiples empalmes alternativos de sus ARNm, que conducen a una variedad de isoformas (Ornitz et al., J. Biol. Chem. 271:15292, 1996; Véase también Swiss-Prot P2182 y las isoformas P2182-1 a -2 para las secuencias de FGFR2 y sus isoformas). De manera notable, existen formas que contienen los tres dominios Ig (isoforma a) o solamente los dos dominios Ig, dominios D2 y D3 sin D1 (isoforma (3). De particular importancia en FGFR1 - FGFR3, mientras todas las formas contienen la primera mitad de D3 designada Illa, se pueden utilizar dos exones alternativos para la segunda mitad de D3, conduciendo a las formas lllb y lile. Para FGFR2, estos se denominan respectivamente FGFR2lllb y FGFR2IIle (o solamente FGFR2b y FGFR2c); las correspondientes formas beta se denominan FGFR2(beta)lllb y FGFR2(beta)lllc. La forma FGFR2IIIb de FGFR2 (también denominada K-sam-ll {Swiss-Prot se refiere a este como K-sam-IIC1?}) (véase Swiss-Prot P2182-18) es un receptor de alta afinidad tanto para FGF1 como para KGF mientras FGFR2IIle (también denominado K-sam-l) (véase Swiss-Prot P2182-5) se une tanto a FGF1 como a FGF2 bien pero no se une a KGF (Miki et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:246, 1992). Por supuesto, FGFR2lllb es el único receptor para KGF (Ornitz et al., 1996, op. cit.) y por lo tanto también se denomina KGFR.

Los FGFR y sus isoformas se expresan diferencialmente en diferentes tejidos. Notablemente, FGFR2IIIb (y las formas lllb de FGFR1 y FGFR3) se expresan en tejidos epiteliales, mientras FGFRIIIc se expresa en tejidos mesenquimales (Duan et al., J. Biol. Chem. 267:1676, 1992; Ornitz et al., 1996, op. cit.). Ciertos ligandos de FGF de estos receptores tienen un patrón de expresión opuesto. De este modo, los miembros de la subfamilia de FGF3 incluyendo FGF7 (KGF) solamente se unen a FGFRIIIb (Zhang et al., op. cit.) y se expresan en tejidos mesenquimales de manera que pueden ser efectores paracrinos de las células epiteliales (Ornitz et al., 1996, op. cit). En contraste, los miembros de la subfamilia de FGF4 FGF4-6 se unen a FGFR2IIIC y se expresan en linajes

tanto epiteliales como mesenquimales de manera que pueden tener funciones autocrlnas o paracrinas. Debido a los patrones de expresión de las isoformas de FGFR2 y sus ligandos, FGFR2 juega un papel en las interacciones epiteliales-mesenquimales (Finch et al., Dev. Dyn. 23:223, 1995), de manera que no es sorprendente que la inactivación de FGFR2IIIb en ratones conduzca a graves defectos embrionarios y letalidad (De Moerlooze et al., Development 127:483, 2).

Además de unirse a FGFR1-4 con una elevada afinidad, los FGF se unen a proteogllcanos de sulfato de heparina (HSPG) con una baja afinidad. De hecho, la unión de FGF a heparlna/sulfato de heparina (HS) sobre la superficie celular es necesaria para la señalización a través de los FGFR. La Interacción de FGF, especialmente FGF2, con FGFR y heparina ha sido ampliamente estudiada mediante cristalografía de rayos X y análisis mutacional, y ahora se cree que la heparlna/HS participa en la formación de un dímero FGF-FGFR 2:2 simétrico (Mohammadi et al., 25), que conduce a la activación del receptor, la autofosforilación y la transducclón de la señal.

Los FGF median una variedad de respuestas en diferentes tipos de células Incluyendo la proliferación, migración y diferenciación, especialmente durante el desarrollo embrionario (Ornitz et al., op. clt.), y en el adulto están implicadas en la homeostasls y la reparación de tejidos. Por ejemplo, FGF2 estimula la proliferación de (esto es, es mitogénico para) ciertas células Incluyendo fibroblastos y células endoteliales y es un factor de supervivencia anti-apoptótico para ciertas células tales como células neurales (Okada-Ban, op. cit.). El FGF2 también estimula la diferenciación (morfogénesis) y la migración (motilidad) de células endoteliales (Dow et al., Urology 55:8, 2). Varios FGF, especialmente FGF1 y FGF2, son potentes factores angiogénlcos (Presta et al., Cytokine and Growth Factor Rev. 16:159, 25).

La importancia del sistema FGF en el desarrollo ha sido destacada por el descubrimiento de numerosas mutaciones en los FGFR1-3 asociados con trastornos esqueléticos congénitos humanos Incluyendo el síndrome de craniosinostosis (fusión prematura de las suturas craneales) (Wilkie et al., Cytokine Growth Factor Revs 16:187,

25). Estas enfermedades genéticas son normalmente dominantes debido a que las mutaciones asociadas conducen a una ganancia de función, a menudo facilitando la dimerización del receptor. Notablemente, el trastorno de craniosinostosis grave con síndrome de Apert (AS) está asociado con una de dos mutaciones (Ser-252 -> Trp o Pro-253 -> Arg) en la reglón conectora D2-D3 conservada de FGFR2 que incrementan la afinidad de unión al ligando (Ibrahimi et al, Proc. Nati. Acad. Sci USA 98:7182, 21).

Se ha Informado de que FGF2 y otros FGF juegan un papel en el cáncer, tanto estimulando la angiogénesis como las células tumorales directamente (Grase et al., Cytokine Growth Factor Revs. 16:179, 25; Presta et al., op cit.). El ARN de FGFR2lllb es expresado en muchos tipos de tumores (Finch et al., J. Nati, Cáncer Inst. 98:812, 26), a menudo... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal (mAb) que se une al receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGFR2), en donde el mAb comprende tres CDR de la cadena ligera que tienen las secuencias de aminoácidos KASQGVSNDVA (CDR-L1), SASYRYT (CDR-L2) y QQHSTTPYT (CDR-L3) respectivamente; y tres CDR de la cadena pesada que tienen las secuencias de aminoácidos TYNVH (CDR-H1), SIYPDNGDTSYNQNFKG (CDR-H2) y GDFAY (CDR-H3) respectivamente.

2. El mAb de la reivindicación 1 que es un fragmento Fab o F(ab')2 o un anticuerpo de cadena sencilla.

3. El mAb de cualquier reivindicación anterior que es quimérico.

4. El mAb de la reivindicación 1 que está humanizado.

5. El mAb de la reivindicación 1, que está humanizado, y en donde la región variable de la cadena ligera tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 2 y la región variable de la cadena pesada tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 5.

6. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 5, en donde los residuos H27, H28, H3, H48, y H67 por la numeración de Kabat están ocupados por el residuo que ocupa la correspondiente posición de la cadena pesada mostrada en el SEQ ID NO:4.

7. El mAb de la reivindicación 1, que está humanizado, y en donde la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 2 y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 5.

8. El mAb de cualquier reivindicación anterior, que es del isotipo lgG1 humano.

9.- Una composición farmacéutica que comprende un mAb que se une al receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGFR2) y comprende las tres CDR de la cadena ligera que tienen las secuencias de aminoácidos KASQGVSNDVA (CDR-L1), SASYRYT (CDR-L2) y QQHSTTPYT (CDR-L3) respectivamente; y tres CDR de la cadena pesada que tienen las secuencias de aminoácidos TYNVH (CDR-H1), SIYPDNGDTSYNQNFKG (CDR-H2) y GDFAY (CDR-H3) respectivamente.

1. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en donde el mAb comprende una cadena ligera que tiene la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 9 y una cadena pesada que tiene la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1 con la condición de que la lisina C-terminal del SEQ ID NO: 1 pueda faltar.

11. Un mAb de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso en el tratamiento del cáncer.

12. El mAb para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicho cánceres cáncer gástrico.