Anticuerpos monoclonales humanizados para el factor de crecimiento de hepatocitos.

Anticuerpo monoclonal humanizado (mAb) que se une a y neutraliza el factor de crecimiento de hepatocitos humano (HGF),

que comprende una región variable de cadena pesada variable que presenta la secuencia de aminoácidos de HuL2G7 marcado de la figura 2A y una región variable de cadena ligera madura que presenta la secuencia de aminoácidos de HuL2G7 marcado de la figura 2B.

Anticuerpos monoclonales humanizados para el factor de crecimiento de hepatocitos.

Declaración de los derechos gubernamentales El trabajo que se describe en la presente solicitud se financió en parte por la subvención 2R44CA101283-02 de los National Institutes of Health. El gobierno de EE.UU. puede tener ciertos derechos sobre la presente invención.

Campo de la invención La presente invención se refiere generalmente a la combinación de anticuerpos monoclonales (mAb) y tecnologías del ADN recombinante para desarrollar nuevos productos biológicos y, más particularmente, por ejemplo, para la obtención de anticuerpos monoclonales que se unan a, y neutralicen, el factor de crecimiento de hepatocitos.

Antecedentes de la invención El factor de crecimiento de los hepatocitos humanos (HGF) es un polipéptido heterodimérico multifuncional producido por las células mesenquimáticas. El HGF ha mostrado estimular la angiogénesis, morfogénesis y mutagénesis, así como el crecimiento y dispersión de diversos tipos celulares (Bussolino et al., J. Cell. Biol. 119: 629, 1992; Zarnegar and Michalopoulos, J. Cell. Biol. 129:1177, 1995; Matsumoto et al., Ciba. Found. Symp. 212:198, 1997; Birchmeier and Gherardi, Trends Cell. Biol. 8:404, 1998; Xin et al. Am. J. Pathol. 158:1111, 2001) . Las actividades pleyotrópicas del HGF son mediadas mediante su receptor, una tirosina cinasa transmembranal codificada por el protooncogén cMet. Además de regular varias funciones celulares normales se ha mostrado que HGF y su receptor cMet están implicados en la iniciación, invasión y metástasis de los tumores (Jeffers et al., J. Mol. Med. 74:505, 1996; Comoglio & Trusolino, J. Clin. Invest. 109:857, 2002) . HGF/cMet se coexpresan, a menudo, se sobreexpresan, en varios tumores sólidos humanos, que incluyen tumores derivados de pulmones, colon, recto, estómago. Riñones, ovarios, piel, mieloma múltiple y tejido del tiroides (Prat et al., Int. J. Cancer 49:323, 1991; Chan et al., Oncogene 2:593, 1988; Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993; Derksen et al., Blood 99:1405, 2002) . HGF actúa como un factor de crecimiento autocrino (Rong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4731, 1994; Koochekpour et al., Cancer Res. 57:5391, 1997) y paracrino (Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993) y como un regulador antiapoptósico (Gao et al., J. Biol. Chem. 276:47257, 2001) para estos tumores.

El HGF es una proteína de 102 kDa, con una secuencia y similitud estructural con el plasminógeno y otros enzimas de la coagulación sanguínea (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993) . El HGF humano se sintetiza como un precursor de 728 aminoácidos (preproHGF) , que experimenta una partición intracelular a una forma de cadena única e inactiva (proHGF) (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Rosen et al., J. Cell. Biol. 127:1783, 1994) . Después de la secreción extracelular, proHGF se escinde para dar lugar

a la molécula heterodimérica unida al disulfuro, biológicamente activa, compuesta por una subunidad α y otra β (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Naldini et al., EMBO J. 11:4825, 1992) . La subunidad α contiene 440 residuos (60 kDa con glicosilación) , formada por el dominio N-terminal de la hairpina y cuatro dominios proteicos que se pliegan en bucles estabilizados por 3 enlaces disulfuro (kringle) . La subunidad β contiene 234 residuos (34 kDa)

y, posee un dominio de tipo serín-proteasa, al que le falta actividad proteolítica. El HGF posee dos sitios únicos de unión celular específica: uno de alta afinidad (Kd = 2 x 10-10 M) para el receptor cMet y otro de escasa afinidad (Kd = 10-9 M) para los proteoglicanos de sulfato de heparina (HSPG) , que se encuentran en la superficie celular y en la matriz extracelular (Naldini et al., Oncogene 6:501, 1991; Barcelli et al., J. Biotechnol. 37:109, 1994; Sakata et al., J. Biol. Chem., 272:9457, 1997) .

El receptor cMet constituye un miembro de la familia de receptores tipo IV de proteínas tirosin-quinasa. El gen cMet en su longitud completa se clonó e identificó como el proto-oncogén cMet (Cooper et al., Nature 311:29, 1984; Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6379, 1987) . La NK2 (una proteína que abarca el extremo N y los dos primeros dominios proteicos que se pliegan en bucles estabilizados por 3 enlaces disulfuro de la subunidad α) , es suficiente para la unión de cMet y la activación de la cascada señalética para la movilidad, requiriéndose, sin embargo, la longitud completa de la proteína para la respuesta mitogénica (Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Biol. 8:229, 1993) . HSPG se une a HGF mediante la interacción con el extremo N de HGF.

Se ha informado de que HGF/cMet juegan papeles importantes en varios aspectos del desarrollo del cáncer, tales como la iniciación tumoral, invasión, metástasis, regulación de la apóptosis y de la angiogénesis. Se han realizado distintas aproximaciones investigadoras para obtener una molécula antagonista efectiva: proteínas HGF truncadas, tales como NK1 (dominio N-terminal más el dominio 1 proteico que se pliega en bucles estabilizados por enlaces disulfuro Lokker et al., J. Biol. Chem. 268:17145, 1993) , NK2 (dominio N-terminal más los dominios proteicos que se pliegan en bucles estabilizados por enlaces disulfuro 1 y 2; Chan et al., Science 254:1382, 1991) y NK4 (dominio Nterminal más cuatro dominios proteicos que se pliegan en bucles estabilizados por enlaces disulfuro Kuba et al., Cancer Res. 60:6737, 2000) ; mAb anti c-Met (Dodge, Master’s Thesis San Francisco State University, 1998) ; y mAb anti-HGF (Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:7443, 2001) .

Las NK1 y NK2 pueden competir de modo efectivo con la unión de HGF a su receptor pero se ha informado de que presentan actividades agonistas parciales in vitro (Cioce et al., J. Biol. Chem. 271:13110, 1996; Schwall et al., J. Cell. Biol. 133:709, 1996) , más que actividades puramente antagonistas, tal como se desea. Más recientemente, Kuba et al., Cancer Res. 60:6737, 2000, informaron que NK4 podría inhibir parcialmente el crecimiento primario y la metástasis de los tumores LLC pulmonares murinos, en un modelo de ratones desnudos, mediante una infusión continua de NK4. Sin embargo, el hecho de que NK4 tuviera que administrarse continuamente para obtener una inhibición parcial del crecimiento de los tumores primarios, indica una semivida biológica potencialmente corta de la molécula NK4 y/o la falta de potencia.

Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:7443, 2001, informaron de que la administración de un cóctel de tres mAb anti-HGF, que se seleccionaron basándose en su capacidad para inhibir la actividad dispersa del HGF in vitro, pudo inhibir el crecimiento de tumores humamos en el modelo de xenoinjertos en ratones desnudos. Postularon que eran necesarios tres mAb que reconocieran tres sitios de unión distintos en HGF para inhibir las bioactividades de HGF in vivo: dos mAb inhibieron la unión de HGF a cMet y un mAb inhibió la unión de HGF a la heparina.

Recientemente se ha informado de que, utilizando la tecnología murina transgénica, se desarrollaron mAb humanos que se unían individualmente y neutralizaban el HGF (Burgess et al., WO 2005/017107A2 y Burgess et al. Cancer Res 66:1721, 2006. Sin embargo, de éstos, por lo menos el mAb 2.12.1, que era aparentemente el más potente en los modelos de xenoinjerto tumoral, no inhibió la angiogénesis. Se ha desarrollado un mAb L2G7 murino que neutraliza todas las actividades biológicas de HGF ensayadas, incluyendo la angiogénesis (patente US 2005019327) , y Kim et al., Clin Cancer Res 12:1292, 2006.

De este modo, es necesario un anticuerpo monoclonal humanizado que bloquee la actividad biológica de HGF in vitro y in vivo. La presente invención consigue esto, y con otras necesidades.

Sumario de la invención reivindicada El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones, y cualquier información que no forme parte de ellas, se proporciona sólo como tal. Se da a conocer un mAb humanizado neutralizante para el factor de crecimiento de hepatocitos humanos (HGF) . El mAb inhibe por lo menos, y preferentemente, varias de las actividades biológicas del HGF, incluyendo la unión a su receptor cMet, la inducción de la dispersión de células como las renales caninas Madin-Darby, la inducción de la proliferación de las células epiteliales pulmonares Lu de 1 Mv y del visón de los hepatocitos, y/o de HUVEC, y la estimulación de la angiogénesis. Un mAb anti-HGF humanizado inhibe muy preferentemente, completamente, el crecimiento de un xenoinjerto tumoral humano en un ratón. El mAb humanizado es un mAb L2G7 humanizado. En una... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo monoclonal humanizado (mAb) que se une a y neutraliza el factor de crecimiento de hepatocitos humano (HGF) , que comprende una región variable de cadena pesada variable que presenta la secuencia de aminoácidos de HuL2G7 marcado de la figura 2A y una región variable de cadena ligera madura que presenta la secuencia de aminoácidos de HuL2G7 marcado de la figura 2B.

2. Anticuerpo monoclonal humanizado (mAb) según la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena pesada madura que presenta la secuencia de aminoácidos de HuL2G7 marcado de la figura 2A, salvo que el primer aminoácido se reemplaza con glutamina (Q) y una región variable de cadena ligera madura que presenta la secuencia de aminoácidos de HuL2G7 marcado de la figura 2B.

3. mAb humanizado según la reivindicación 1 o 2, que es del isotipo (IgG1, κ) .

4. Estirpe celular que produce un mAb según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

5. Composición farmacéutica que comprende un mAb según las reivindicaciones 1 a 3.

6. Composición farmacéutica según la reivindicación 5 para su utilización en el tratamiento del cáncer.

7. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, en el que dicho cáncer es el glioblastoma.

8. mAb según las reivindicaciones 1 a 3, para su utilización en el tratamiento del cáncer.

9. mAb según la reivindicación 8, en el que dicho cáncer es el glioblastoma.