Anticuerpos contra inhibidor de la vía de factor tisular.

Anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse específicamente al dominio de K2 de inhibidor de la vía de factor tisular (TFPI),

donde dicho anticuerpo es capaz de unirse específicamente a un epítopo que comprende el residuo R17 de SEC ID n.º: 2 y el KD de dicho anticuerpo es menos de 0.8 nM, como se determina usando resonancia de plasmon de superficie.

Anticuerpos contra inhibidor de la vía de factor tisular

Campo de la Invención [0001] La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen específicamente a un inhibidor de la vía de factor tisular (TFPI) .

Antecedentes de la Invención [0002] En sujetos con una coagulopatía, tal como en seres humanos con hemofilia A y B, varios pasos de la cascada de coagulación se hacen disfuncionales debido, por ejemplo, a la ausencia o presencia insuficiente de un factor de coagulación. Esa disfunción de una parte de la cascada de coagulación da por resultado coagulación de la sangre insuficiente y sangrado potencialmente amenazante para la vida, o daño a órganos internos, tales como las articulaciones. Sujetos tales como seres humanos con hemofilia A y B pueden recibir terapia de reemplazo de factor de coagulación tal como FVIIIa o FIXa exógeno, respectivamente. Sin embargo, esos pacientes están en riesgo de desarrollar “inhibidores” (anticuerpos) a esos factores exógenos, haciendo inefectiva la terapia que anteriormente era eficiente. Además, los factores de coagulación exógenos sólo se pueden administrar por vía intravenosa, lo cual es de inconveniencia y malestar considerables para los pacientes. Por ejemplo, los bebés y niños que gatean pueden tener catéteres intravenosos quirúrgicamente insertados en una vena del pecho, para que sea garantizado el acceso venoso. Esto los deja en gran riesgo de desarrollar infecciones bacterianas. Los sujetos con una coagulopatía sólo pueden recibir terapia después de que haya comenzado un sangrado, más que como una medida de precaución, que a menudo causa efecto en su calidad de vida general.

Por lo tanto, aún hay muchas necesidades médicas no satisfechas en la comunidad hemofílica, en particular, y en sujetos con coagulopatías, en general.

Cuando la pared de un vaso está lesionada, el factor tisular (TF) está expuesto a los contenidos de sangre circulante y TF forma un complejo con el Factor VII/Factor VII activado (FVII/FVIIa) sobre la superficie de células que tienen TF. Esto conduce a la activación del Factor X (FX) a FXa que junto con FVa genera una cantidad limitada de trombina (FIIa) . Pequeñas cantidades de trombina activan las plaquetas, que dan por resultado exposición de superficie de fosfolípidos que soporta la unión del complejo de tenasa que consiste de FVIIIa/FIXa.

El complejo de tenasa produce grandes cantidades de FXa, que subsecuentemente facilita una ráfaga de trombina completa. Una ráfaga de trombina completa es necesaria para la formación de una estructura de fibrina mecánicamente fuerte y estabilización del tapón hemostático. FVIII o FIX está ausente o presente a niveles bajos en pacientes con hemofilia, y debido a la falta de actividad de tenasa, la capacidad para generar FXa es baja e insuficiente para soportar la fase de propagación de la coagulación. Por el contrario, la fase de inicio mediada por TF no es dependiente de la formación del complejo de tenasa. Sin embargo, la vía de TF, poco después de una generación de FXa inicial, será bloqueada por inhibidores del plasma [0006] El inhibidor de la vía de factor tisular (TFPI) regula descendentemente la coagulación en curso al neutralizar la actividad catalítica de FXa y al inhibir el complejo TF-FVIIa en presencia de FXa. TFPI ya sea que inhiba el complejo TF/FVIIa/FXa sobre la superficie celular o inhiba el FXa liberado seguido por inhibición de FVIIa/TF.

Int. Jour. Haem. Fibrin (1995) , 6, 5, 388-394 divulga un anticuerpo TFPI policlonal de cabra. Tras la publicación de este artículo, Warn Cramer y Rapaport utilizaron el mismo método que el descrito para cultivar un pAb de cabra (Arterioscler. Thromb. (1993) , 13, 1551-1557) . Este pAb se probó y se encontró que exhibe la propiedad indeseable de dar lugar a una reducción en el número de plaquetas (véase Fig. 4) .

Blood; Amer. Soc. Haem (2004) , 104, 11, 788 divulga un anticuerpo TFPI que se direge al dominio K2 de TFPI (véase líneas 23-24 del resumen) . No se proporciona información adicional sobre el anticuerpo.

Throm. Res (1991) , 64, 2, 213-222 es un artículo que expone el efecto que tiene LACI (es decir TFPI) en la coagulación inducida por tromboplastina en plasma normal y hemofílico. El artículo divulga un anticuerpo TFPI policlonal de conejo (pAb) y anticuerpo TFPI monoclonal de ratón (mAb) (véase sección de Materiales, págin 215) , usado para evaluar la función LACI. Este artículo no expone nada sobre la estructura de los anticuerpos que se usaron para evaluar la función LACI, ni examina las propiedades biológicas de pAb y mAb que fueron usados en el experimento del autor.

mAb 2974 es un anticuerpo monoclonal FTPI comercialmente disponible, producido por R&D Systems y disponible para fines de investigación únicamente.

Resumen de la Invención [0011] Los inventores han identificado anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al inhibidor de la vía de factor tisular (“TFPI”, algunas veces denominado “TFPI1”) y de esta manera modula su actividad. La presente invención se refiere a estos anticuerpos y a otros anticuerpos relacionados que se derivan de estos anticuerpos o tienen propiedades de unión similares a estos anticuerpos.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a anticuerpos que se unen específicamente a inhibidor de la vía de factor tisular (TFPI) y que reducen el tiempo de coagulación en, por ejemplo, (a) plasma deficiente en FVIII humano y/o (b) sangre entera humana.

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse específicamente al dominio K2 de TFPI, donde dicho anticuerpo es capaz de unirse específicamente a un epítopo que omprende el residuo R17 de SEC ID n.º 2 y el KD de dicho anticuerpo es menor de 0.8 nM, como se determina utililzando resonancia plasmon superficial.

Un anticuerpo comprende la región variable de cadena ligera de SEC ID n.º: 4 y la región variable de cadena pesada de SEC ID n.º: 8. Otro anticuerpo comprende la región variable de cadena ligera de SEC ID n.º: 15 y la región variable de cadena pesada de SEC ID n.º: 18.

La invención también provee polinucleótidos que codifican un anticuerpo de la invención, tales como polinucleótidos que codifican la cadena ligera de un anticuerpo y/o la cadena pesada de un anticuerpo de la invención.

La invención también provee composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo o polinucleótido de la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Los anticuerpos, polinucleótidos y composiciones de la invención también se proveen para usarse en (a) el tratamiento o prevención de una coagulopatía (trastorno de sangrado) o (b) la estimulación de coagulación sanguínea. Es decir, la invención provee un método para (a) el tratamiento o prevención de una coagulopatía (trastorno de sangrado) o (b) la estimulación de coagulación sanguínea, el método comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de un anticuerpo, polinucleótido o composición de la invención.

Además, la invención provee regímenes de dosis del anticuerpo monoclonal de la invención.

Breve Descripción de las Figuras [0019]

La figura 1 muestra las secuencias de los dominios VH (A) y VL (B) de anti-TFPI4F36A1B2 de ratón (denominado aquí también MuTFPI4F36 o 4F36) , alineadas con las secuencias para la línea germinal humana y la versión injertada con CDR inicial de TFPI4F36 humanizado. El esquema de numeración de Kabat está indicado arriba de las secuencias.

Las figura 2 muestra las secuencias de nucleótidos y secuencias de polipéptido traducidas para las secuencias de VH y VL del anticuerpo TFPI4F36A1B2 de ratón (MuTFPI4F36) .

La figura 3 muestra las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera (A) y pesada (B) de fragmentos Fab del anticuerpo 4F36 de ratón, MuTFPI4F36. La numeración arriba de las secuencias se muestra en conformidad con Kabat. Posiciones correspondientes a lazos de CDR están en texto resaltado subrayado en negrita en la numeración de Kabat. Los residuos de aminoácidos que constituyen el parátopo son resaltados en texto subrayado y en negrita. El parátopo es determinado a partir de la estructura de rayos X del complejo entre el Fab de MuTFPI4F36 y el dominio TFPI K2 y se define como residuos en el Fab que tienen un átomo pesado dentro de una distancia de menos de 4 Å de un átomo pesado en K2.

La figura 4 muestra la secuencia de TFPI (secuencia de péptido de señal omitida) . Los dominios de Kunitz se muestran en negrita: dominio de TFPI Kunitz 1 = aminoácidos 26 a 76; dominio... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse específicamente al dominio de K2 de inhibidor de la vía de factor tisular (TFPI) , donde dicho anticuerpo es capaz de unirse específicamente a un epítopo que comprende el residuo R17 de SEC ID n.º: 2 y el KD de dicho anticuerpo es menos de 0.8 nM, como se determina usando resonancia de plasmon de superficie.

2. Anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse específicamente al dominio de K2 de inhibidor de la vía de factor tisular (TFPI) , donde dicho anticuerpo es capaz de unirse a un epítopo que comprende E10, E11, D12, P13, R17, Y19, T21, Y23, F24, N26, Q28, Q31, C32, E33, R34, F35, K36 y L50 de SEC ID n.º: 2.

3. Anticuerpo monoclonal, según la reivindicación 1 o 2, donde el KD de dicho anticuerpo es menor de 0.7 nM, tal como menos de 0.6 nM, tal como menos de 0.5 nM, tal como menos de 0.4 nM, tal como menos de 0.3 nM, tal como menos de 0.2 nM, tal como menos de 0.1 nM, tal como menos de 0.05 nM, tal como menos de 0.025 nM como se determina usando resonancia de plasmon de superficie.

4. Anticuerpo monoclonal según las reinvindicaciones 1-3, donde la cadena ligera de ese anticuerpo comprende residuos de aminoácidos:

• E, en la posición correspondiente a la posición 31,

• S, en la posición correspondiente a la posición 32,

• D, en la posición correspondiente a la posición 33,

• Y, en la posición correspondiente a la posición 37,

• A, en la posición correspondiente a la posición 96,

• T, en la posición correspondiente a la posición 97 y

• F, en la posición correspondiente a la posición 99

de SEC ID n.º: 15;

y donde la cadena pesada de ese anticuerpo comprende residuos de amino ácidos:

• N, en la posición correspondiente a la posición 31,

• R, en la posición correspondiente a la posición 53,

• S, en la posición correspondiente a la posición 54,

• Y, en la posición correspondiente a la posición 57,

• Y, en la posición correspondiente a la posición 59,

• F, en la posición correspondiente a la posición 60,

• P, en la posición correspondiente a la posición 61,

• D, en la posición correspondiente a la posición 62,

• Q, en la posición correspondiente a la posición 65,

• Y, en la posición correspondiente a la posición 102,

• D, en la posición correspondiente a la posición 103 y

• D, en la posición correspondiente a la posición 106

de SEC ID n.º 18.

5. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 4, donde dicha cadena pesada además comprende una S en la posición correspondiente a la posición 52 de SEC ID n.º: 18 y/o donde la cadena ligera además comprende una H en la posición correspondiente a la posición 98 de SEC ID n.º: 15 y la cadena pesada además comprende una S en la posición correspondiente a la posición 56 de SEC ID n.º: 18.

6. Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende una secuencia CDR3 de aminoácidos 99 a 110 (LGGYDEGDAMDS) de SEC ID n.º 18, donde uno, dos o tres de estos aminoácidos se pueden sustituir por un aminoácido diferente.

7. Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la cadena pesada de ese anticuerpo comprende:

• una secuencia CDR1 de aminoácidos 31 a 35 (NYAMS) de SEC ID n.º: 18, donde uno de estos aminoácidos puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR2 de aminoácidos 50 a 66 (TISRSGSYSYFPDSVQG) de SEC ID n.º: 18, donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR1 de aminoácidos 24 a 39 (KSSQSLLESDGKTYLN) de SEC ID n.º: 15, donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o

y la cadena ligera de ese anticuerpo comprende:

• una secuencia CDR2 de aminoácidos 55 a 61 (LVSILDS) de SEC ID n.º: 15, donde uno o dos de estos aminoácidos 5 pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o • una secuencia CDR3 de aminoácidos 94 a 102 (LQATHFPQT) de SEC ID n.º: 15, donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente.

8. Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, donde dicha sustitución de aminoácido es una sustitución conservativa.

9. Anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse al dominio de Kunitz 2 (K2) del inhibidor de la vía de factor tisular

(TFPI) , donde la cadena pesada de ese anticuerpo comprende: 15

• una secuencia CDR1 de aminoácidos 31 a 35 (NYAMS) de SEC ID n.º: 18 y

• una secuencia CDR2 de aminoácidos 50 a 66 (TISRSGSYSYFPDSVQG) de SEC ID n.º: 18 y

• una secuencia CDR3 de aminoácidos 99 a 110 (LGGYDEGDAMDS) de SEC ID n.º: 18

y donde la cadena ligera de ese anticuerpo comprende:

• una secuencia CDR1 de aminoácidos 24 a 39 (KSSQSLLESDGKTYLN) de SEC ID n.º: 15; y 25

• una secuencia CDR2 de aminoácidos 55 a 61 (LVSILDS) de SEC ID n.º: 15; y

• una secuencia CDR3 de aminoácidos 94 a 102 (LQATHFPQT) de SEC ID n.º: 15.

10. Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde la cadena ligera de ese anticuerpo comprende SEC ID n.º: 15 y la cadena pesada de ese anticuerpo comprende SEC ID n.º: 18.

11. Un anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde la cadena ligera de ese anticuerpo comprende SEC ID n.º: 21 y la cadena pesada de ese anticuerpo comprende SEC ID n.º: 24. 35

12. Un anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que es capaz de neutralizar la inhibición por TFPI de FVIIa/TF/FXa unido a membrana en por lo menos 55%, tal como por lo menos 60%, tal como por lo menos 65%, tal como por lo menos 70%, tal como por lo menos 75%, tal como por lo menos 80%, tal como por lo menos 85%, tal como por lo menos 90%, tal como por lo menos 95%, tal como hasta 100%, tal como 100%, como se mide en una prueba de inhibidor de FVIIa/TF/FXa, cuando TFPI es saturado con el anticuerpo.

13. Célula eucariótica que expresa el anticuerpo monoclonal, o fragmento de este, según cualquiera de las reivindicaciones 1-10. 45

14. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-12 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

15. Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para uso en el tratamiento de un 50 sujeto con coagulopatía.

16. Anticuerpo monoclonal para uso según la reivindicación 15, donde dicho sujeto tiene coagulopatía congénita, adquirida o iatrogénica, tal como hemofilia A, con o sin inhibidores, hemofilia B, con o sin inhibidores.

FIGURA 1

FIG. 2A

FIG. 2B FIG. 3A

FIG. 3B

FIG. 10A

FIG. 20

FIG. 22

FIG. 24