Anticuerpos anti-GM-CSF y usos de los mismos.

Un anticuerpo humano o humanizado aislado, o fragmento funcional del mismo,

que comprende una región de unión con el antígeno que es específica para el GM-CSF humano y comprende una secuencia de H-CDR1 de GFTFSSYWMN, una secuencia de H-CDR2 de GIENKRAGGATFYAASVKG, GIESKWAGGATYYAAGVKG, o GIENKYAGGATYYAASVKG, una secuencia de H-CDR3 de GFGTDF, una secuencia de L-CDR1 de SGDSIGKKYAY, una secuencia de L-CDR2 de KKRPS, y una secuencia de L-CDR3 de SAWGDKGM.

Anticuerpos anti-GM-CSF y usos de los mismos FUNDAMENTO DE LA INVENCIÓN

El factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos, GM-CSF, fue identificado originalmente como un factor de crecimiento hematopoyético. Es producido por varios tipos de células entre las que se incluyen linfocitos, monocitos, células endoteliales, fibroblastos y algunas células malignas (Metcalf et al., 1986; Clark y Kamen, 1987; Hart et al., 1988; Metcalf et al., 1986) . Además de tener la función de estimulación del crecimiento y diferenciación de células precursoras hematopoyéticas, el GM-CSF se descubrió también como poseedor de una variedad de efectos sobre las células del sistema inmunitario que expresan el receptor de GM-CSF (para una revisión véanse Hamilton, 2002; de Groot et al., 1998) . La más importante de estas funciones es la activación de los monocitos, macrófagos y granulocitos en varios procesos inmunológicos e inflamatorios (Gasson et al, 1990b; Gasson et al, 1990a; Hart et al., 1988; Rapoport et al., 1992) .

El GM-CSF maduro es una proteína monomérica de 127 aminoácidos con dos sitios de glicosilación. El grado variable de la glicosilación tiene por resultado un margen de peso molecular entre 14 kDa y 35 kDa. El GM-CSF no glicosilado y glicosilado muestran una actividad similar in vitro (Cebon et al., 1990) . El análisis cristalográfico del GM-CSF reveló una estructura en forma de barril compuesta por cuatro hélices alfa cortas (Diederichs et al., 1991) . El plegamiento global es similar al de otros factores de crecimiento como la hormona del crecimiento, la interleucina-2 y la interleucina-4.

El GM-CSF ejerce su actividad biológica mediante la unión con su receptor (Kastelein y Shanafelt, 1993; Sisson y Dinarello, 1988) . Los sitios más importantes de la expresión del receptor de GM-CSF (GM-CSF-R) están en la superficie de las células mieloides y de las células endoteliales, mientras que los linfocitos son GM-CSF-R negativos. El receptor nativo está compuesto por al menos dos subunidades, alfa y beta. La subunidad alfa confiere especificidad de ligando y se une a GM-CSF con una afinidad nanomolar (Gearing et al., 1989; Gasson et al., 1986) . La subunidad beta es también parte de los complejos de receptor de interleucina-3 e interleucina-5 y, en asociación con la subunidad alfa del receptor de GM-CSF y GM-CSF, conduce a la formación de un complejo con afinidad de unión picomolar (Hayashida et al., 1990) . Los dominios de unión de GM-CSF para el receptor han sido cartografiados: el GM-CSF interacciona con la subunidad beta de su receptor a través de una región muy restringida en la primera hélice alfa del GM-CSF (Shanafelt et al., 1991b; Shanafelt et al., 1991a; López et al., 1991) . La unión a la subunidad alfa pudo ser cartografiada hasta la tercera hélice alfa, la hélice C, los residuos iniciales del bucle que une a las hélices C y D, y a la cola carboxiterminal de GM-CSF (Brown et al., 1994) .

La formación del complejo receptor trimérico GM-CSF conduce a la activación de cascadas de señalización de complejo que implican moléculas de las familias JAK/STAT, Shc, Ras, Raf, las MAP cinasas, fosfatidilinositol-3cinasa y NFkB, que llevan finalmente a la trascripción de c-myc, c-fos y c-jun. La activación se induce principalmente por la subunidad beta del receptor (Hayashida et al, 1990; Kitamura et al., 1991; Sato et al, 1993) . La subunidad beta compartida es también responsable de las funciones de solapamiento ejercidas por IL-3, IL-5 y GM-CSF (para una revisión véase de Groot et al., 1998) .

Aparte de su actividad de estimulación del crecimiento hematopoyético y de la diferenciación, el GM-CSF funciona especialmente como una citocina proinflamatoria. Los macrófagos y monocitos, así como los neutrófilos y eosinófilos se activan por el GM-CSF, dando por resultado la liberación de otras citocinas y quimiocinas, proteasas que degradan la matriz, el aumento de la expresión de HLA y el aumento de la expresión de moléculas de adhesión celular o receptores para quimiocinas CC. Estos últimos, a su vez, conducen a un aumento de la quimiotaxis de células inflamatorias en el tejido inflamado (Chantr y et al., 1990; Hamilton, 2002; Sisson y Dinarello, 1988; Zhang et al., 1998; Hamilton et al., 1993; López et al, 1986; Cheng et al, 2001; Gómez-Cambronero et al, 2003) . Con frecuencia el GM-CSF ejerce su actividad en sinergia con otros factores estimuladores inflamatorios como otras citocinas o LPS, p. ej. los neutrófilos tratados con GM-CSF en combinación, p. ej., con LPS mostrarán un aumento en la explosión oxidativa (Kaufman et al., 1989; Rapoport et al. , 1992) .

GM-CSF como diana para la terapia anti-inflamatoria:

Debido a sus diversas funciones de activación en el sistema inmunitario, el GM-CSF puede ser considerado como un objetivo para la terapia anti-inflamatoria. Las enfermedades inflamatorias crónicas y agudas como la artritis reumatoide (RA) , la esclerosis múltiple (MS) , la enfermedad de Crohn, la psoriasis, la asma, la dermatitis atópica o el choque pueden beneficiarse del bloqueo de la actividad de GM-CSF y la subsiguiente reducción de las actividades perjudiciales de células sensibles a GM-CSF (Hamilton, 1993; Zhang et al, 1998; Hamilton, 2002) .

Artritis:

Varios grupos indicaron que el GM-CSF, así como su receptor, están presentes en la articulación sinovial de pacientes con artritis (Alvaro-Gracia et al, 1991; Xu et al, 1989; Haworth et al., 1991) . Adicionalmente, se demostró que el GM-CSF causa brotes de artritis reumatoide en pacientes tratados con GM-CSF para la neutropenia en el síndrome de Felty (Hazenberg et al., 1989) o después de una quimioterapia (de Vries et al., 1991) .

Los primeros indicios sobre la utilidad de anticuerpos que bloquean el GM-CSF para el tratamiento de la artritis vinieron de estudios in vivo en ratones (Campbell et al, 1997; Campbell et al, 1998; Cook et al., 2001) . Concretamente, Cook et al. señalaron que los anticuerpos neutralizantes contra GM-CSF manifestaban eficacia en un modelo de artritis inducida por colágeno. El bloqueo de GM-CSF condujo a una reducción de la gravedad de la enfermedad en relación con la inflamación, la destrucción de cartílago y la progresión de la enfermedad en las extremidades afectadas inicialmente o la progresión a otras extremidades.

Hay varios efectos de una terapia anti-GM-CSF de la que podrían beneficiarse los pacientes con artritis reumatoide o con otras enfermedades inflamatorias.

Se espera que el bloqueo de GM-CSF inhiba o reduzca:

a) la activación y el número de monocitos maduros, macrófagos y neutrófilos. Especialmente los neutrófilos y macrófagos abundan en el líquido sinovial y la membrana. Se ha demostrado que el número de macrófagos en el sinovio se correlaciona con el grado de erosión en las articulaciones con AR (Mulherin et al., 1996; Burmester et al., 1997) . Los macrófagos son la fuente de una diversidad de otras citoquinas proinflamatorias y proteasas que degradan la matriz. La producción de H2O2 por los neutrófilos es parte de los procesos destructivos que tienen lugar en las articulaciones artríticas (Babior, 2000) .

b) la diferenciación de células dendríticas mieloides (DCs) y la activación de DCs sinoviales (= sinoviocitos) . El GM-CSF regula por exceso y mantiene la expresión de HLA de clase II en DCs y sinoviocitos con AR (Alvaro-Gracia J.

M. et al., 1991) . Las DCs están instruidas dentro de la articulación para adquirir funciones asociadas con la activación selectiva de las células T inflamatorias. Alelos HLA-DR específicos han sido relacionados con la susceptibilidad a la AR, y la activación de las células T a través de la presentación de antígeno de las DCs pueden desempeñar un papel crucial en este tipo de enfermedad inmunitaria (Santiago-Schwarz et al., 2001) .

Esclerosis múltiple:

En la esclerosis múltiple, los niveles elevados de GM-CSF se correlacionan con la fase activa de MS (Carrieri et al, 1998; McQualter et al., 2001) y los ratones GM-CSF -/- no desarrollan la enfermedad en el sistema modelo para MS, encefalomielitis experimental, EAE (McQualter et al., 2001) .

Asma:

En el asma, se ha publicado el aumento de las cantidades de GM-CSF en el pulmón (Broide y Firestein, 1991) . Al mismo tiempo, los eosinófilos son elevados, en lo que el GM-CSF en sinergia con la interleucina-5 actúa de tres maneras: i) estimula la diferenciación de las células progenitoras en eosinófilos, ii) estimula su activación funcional, y iii) prolonga la supervivencia de eosinófilos en el pulmón (Broide et al, 1992; Yamashita et al., 2002) . Así pues, es probable que la reducción de la supervivencia de los eosinófilos en las vías respiratorias... [Seguir leyendo]

1ª. Un anticuerpo humano o humanizado aislado, o fragmento funcional del mismo, que comprende una región de unión con el antígeno que es específica para el GM-CSF humano y comprende una secuencia de H-CDR1 de GFTFSSYWMN, una secuencia de H-CDR2 de GIENKRAGGATFYAASVKG, GIESKWAGGATYYAAGVKG, o GIENKYAGGATYYAASVKG, una secuencia de H-CDR3 de GFGTDF, una secuencia de L-CDR1 de SGDSIGKKYAY, una secuencia de L-CDR2 de KKRPS, y una secuencia de L-CDR3 de SAWGDKGM.

2ª. Un anticuerpo humano o humanizado o fragmento funcional del mismo según la reivindicación 1ª, que comprende una región de unión con el antígeno que es específica para el GM-CSF humano, en donde dicho 10 anticuerpo humano o humanizado aislado o fragmento funcional del mismo es capaz de (i) bloquear la interacción de 0, 5 μg/ml de GM-CSF humano con la cadena alfa del receptor de GM-CSF humano expresado en aproximadamente 2 x 105 células CHO-K1 en al menos un 50% bajo las siguientes condiciones: (a) la concentración de dicha cadena alfa del receptor de GM-CSF humano expresada en dichas células CHO-K1 es similar a la concentración de la cadena alfa del receptor de GM-CSF humano expresada en aproximadamente 2 x 105 células CHO-GMRA # 11, y

(b) la concentración de dicho anticuerpo humano o humanizado aislado o fragmento funcional del mismo es aproximadamente 5 μg/ml; y (ii) neutralizar 0, 25 ng/ml de GM-CSF humano en un ensayo de proliferación de TF-1, con un valor de IC50 al menos cinco veces menor que el anticuerpo de referencia BVD2-21C11 (BD Biosciences Pharmingen; nº de Cat. 554503) , y/o el anticuerpo MAB215 (R & D Systems; nº de Cat. MAB215) .

3ª. El anticuerpo humano o humanizado o fragmento funcional del mismo según la reivindicación 1ª o 2ª, que 20 comprende una cadena pesada variable elegida entre el grupo que consiste en

(a)

(b)

(c)

4ª. El anticuerpo humano o humanizado o fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª o 2ª, que comprende una cadena ligera variable elegida entre el grupo que consiste en (a)

(b)

(c)

5ª. El anticuerpo humano o humanizado o fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª, que comprende una secuencia H-CDR3 de GFGTDF, una secuencia H-CDR2 de GIENKYAGGATYYAASVKG, una secuencia H-CDR1 de GFTFSSYWMN y una secuencia L-CDR3 de SAWGDKGM, una secuencia L-CDR2 de KKRPS y una secuencia L-CDR1 de SGDSIGKKYAY.

6ª. El anticuerpo humano o humanizado o fragmento funcional del mismo según la reivindicación 5ª, que comprende

(a) la cadena pesada variable de la secuencia de QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMNWVR QAPGKGLEWVSGIENKYAGGATYYAASVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YYCARGFGTDFWGQ GTLVTVSS y

(b) la cadena ligera variable de la secuencia DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGKKYAYWYQQKPGQAPVL VIYK KRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCSAWGDKGMVFGGG TKLTVLGQ.

7ª. El anticuerpo humano o humanizado o fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 6ª, en donde dicho anticuerpo humano o humanizado o fragmento funcional del mismo presenta reacción cruzada con el GM-CSF de rata y/o GM-CSF de Rhesus.

8ª. El anticuerpo humano o humanizado o fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 7ª, en donde dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo es capaz de neutralizar GM-CSF humano en un ensayo de proliferación de TF-1 con un valor de IC50 al menos 10 veces más bajo que el anticuerpo de referencia MAB215 (R&D Systems; nº de cat. MAB215) y/o BVD2-21C11 (BD Biosciences Pharmingen; nº de Cat. 554503) .

9ª. El fragmento de anticuerpo funcional según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 7ª, que es un fragmento de anticuerpo Fab o scFv.

10ª. El anticuerpo humano o humanizado según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 7ª, que es un anticuerpo humano.

11ª. El anticuerpo humano o humanizado según la reivindicación 10ª, que es una IgG.

12ª. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una región de unión con el antígeno de un anticuerpo humano o humanizado o un fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 11ª.

13ª. La secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 12ª, que comprende

(i) una secuencia de nucleótidos elegida entre el grupo que consiste en

(a)

(b)

(c)

(d)

o (ii) una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida bajo condiciones de rigor elevado con la cadena complementaria de la secuencia de (i) (a) , (i) (b) , (i) (c) , o (i) (d) .

14ª. La secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 12ª, que comprende

(i) una secuencia de nucleótidos elegida entre el grupo que consiste en

(a)

(b)

(c)

(d)

o (ii) una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida bajo condiciones de rigor elevado con la cadena 10 complementaria de la secuencia de (i) (a) , (i) (b) , (i) (c) , o (i) (d) .

15ª. Un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 12ª a 14ª.

16ª. Una célula que comprende un vector según la reivindicación 15ª.

17ª. La célula según la reivindicación 16ª, en donde dicha célula es bacteriana o eucariota.

18ª. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano o humanizado o fragmento funcional según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 11ª y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para el mismo.

19ª. La composición farmacéutica según la reivindicación 18ª para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.

20ª. La composición farmacéutica según la reivindicación 19ª para su uso según la reivindicación 19ª, en donde dicha enfermedad inflamatoria se toma de la lista de artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, 5 psoriasis, asma y dermatitis atópica.

21ª. La composición farmacéutica según la reivindicación 19ª, para su uso según la reivindicación 19ª, en donde dicha enfermedad inflamatoria es artritis reumatoide.

22ª. Un anticuerpo humano o humanizado o fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 11ª, para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria solo o en combinación con 10 otros agentes.