Anticuerpos anti-factor D humanizados.

Un anticuerpo ANTI-Factor D o un fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende:

(i) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 5 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 6.

(ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 7 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 8;

(iii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 9 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 10; o

(iv) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 11 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 12.

Anticuerpos anti-factor D humanizados Antecedentes de la invención

El sistema del complemento desempeña un papel central en el aclaramiento de complejos inmunitarios y la respuesta ¡nmunitaria a agentes infecciosos, antígenos foráneos, células infectadas por virus y células tumorales. Sin embargo, el complemento también está implicado en la inflamación patológica y en enfermedades autoinmunitarias. Por lo tanto, la inhibición de la activación excesiva o incontrolada de la cascada del complemento podría proporcionar beneficios clínicos a pacientes con tales enfermedades y afecciones.

El sistema del complemento abarca dos rutas de activación distintas, denominadas rutas clásica y alternativa (V.M. Holers, en Clinical Immunology: Principies and Practice, ed. R. R. Rich, Mosby Press; 1996, 363-391). La ruta clásica es una cascada dependiente de calcio/magnesio que es activada normalmente por la formación de complejos antlgeno-antlcuerpo. La ruta alternativa es una cascada dependiente de magnesio que es activada por depósito y activación de C3 sobre ciertas superficies susceptibles (p. ej., polisacáridos de la pared celular de levaduras y bacterias, y ciertos materiales biopoliméricos). La activación de la ruta del complemento genera fragmentos biológicamente activos de proteínas del complemento, p. ej., las anafilotoxinas C3a, C4a y C5a y complejos de ataque a la membrana (MAC) C5b9, que median las actividades inflamatorias que implican la quimiotaxis de leucocitos, la activación de macrófagos, neutrófilos, plaquetas, mastocitos y células endoteliales, la permeabilidad vascular, la citolisis, y la lesión tisular.

El Factor D es una serina proteasa altamente específica esencial para la activación de la ruta alternativa del complemento. Escinde el factor B unido a C3b, generando la enzima C3b/Bb que es el componente activo de las convertasas C3/C5 de la ruta alternativa. El Factor D puede ser una diana adecuada para la inhibición, ya que su concentración en plasma en seres humanos es muy baja (1,8 pg/ml), y se ha demostrado que es la enzima limitante de la activación de la ruta del complemento alternativa (P.H. Lesavre y H.J. Müller-Eberhard J. Exp Med., 1978; 148: 1498-151; J.E. Volanakis et al., New Eng J Med., 1985; 312: 395-41).

Se ha demostrado que la regulación a la baja de de la activación del complemento es eficaz en el tratamiento de varias indicaciones de enfermedades en modelos animales y en estudios ex vivo, p. ej., lupus eritematoso generalizado y glomerulonefritis (Y. Wang et al., Proc. Nati. Acad. Sci.\ 1996, 93: 8563-8568), artritis reumatoide (Y. Wang et al, Proc Nati Acad Sci., 1995; 92: 8955-8959), bypass cardiopulmonar y hemodiálisis (C.S. Rinder, J. Clin Invest., 1995; 96: 1564-1572), rechazo hiperagudo en trasplante de órganos (T.J. Kroshus et al, Transplantation, 1995; 6: 1194-122), infarto de miocardio (J. W. Homeister et al., J. Immunol: 1993; 15: 155-164; H. F. Weisman et al., Science, 199; 249: 146-151), lesión por reperfusión (E. A. Amsterdam et al, Am J. Physiol., 1995; 268: H448-H457), y síndrome de dificultad respiratoria del adulto (R. Rabinovici et al., J. Immunol, 1992; 149: 1744- 175). Además, otras afecciones inflamatorias y enfermedades de complejos autoinmunitarios/inmunitarios también están estrechamente asociadas con la activación del complemento (V.M. Holers, ídem., B. P. Morgan EurJ. Clin. Invest, 1994: 24: 219-228), incluyendo lesión térmica, asma grave, choque anafiláctico, inflamación intestinal, urticaria, angioedema, vasculitis, esclerosis múltiple, miastenia grave, glomerulonefritis membranoproliferativa y síndrome de Sjógren.

E. J. Tanhehco et al. (Transplant Proc. 1999: 31: 2168-2171) describen el anticuerpo anti-factor D monoclonal murino 166-32 que inhibe la ruta alternativa del sistema del complemento humano.

M. Harboe et al. (Clin. Ex. Immunol. 24: 138: 439-446) utilizan el anti-factor D monoclonal murino para estudiar el papel cuantitativo de la amplificación de la ruta alternativa en la activación del complemento terminal inducida por la ruta clásica.

Existe una necesidad de anticuerpos terapéuticos en el campo de los trastornos mediados por el complemento y los anticuerpos humanizados de la presente invención proporcionan anticuerpos de alta afinidad útiles para satisfacer esta necesidad.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere en general a anticuerpos que comprenden secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera derivadas de las secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo murino 166-32, que es un anticuerpo capaz de inhibir las actividades biológicas asociadas con el Factor D. Por ejemplo, a una concentración de 18 pg/ml (equivalente a aproximadamente 1,5 veces la concentración molar del factor D humano en la sangre; la razón molar de anticuerpo anti-Factor D con respecto al Factor D es de aproximadamente 1,5:1), se puede observar la inhibición significativa de la actividad del complemento alternativa por el anticuerpo (véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.956.17)

En particular, la invención se refiere a un anticuerpo anti-Factor D o un fragmento de anticuerpo que comprenden:

(i) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos

97% con el SEQ ID NO: 5 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 6.

(¡i) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 7 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 8;

(i¡¡) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 9 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 1; o

(iv) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 11 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 12.

En otra realización, la identidad de secuencia es de al menos 98% o al menos 99%.

En una realización, el anticuerpo anti-Factor D o un fragmento del mismo comprende el dominio variable de la

cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 7, en donde el aminoácido de la

posición 14 del SEQ ID NO: 7 es una valina o una leucina.

En otro aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de la invención o un fragmento del mismo.

En otro aspecto, la invención se refiere a un vector que comprende el ácido nucleico de la invención y una célula anfitriona que comprende dicho vector.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende el anticuerpo de la invención o un fragmento del mismo y al uso de dicha composición para el tratamiento de una enfermedad ocular mediada por el complemento tal como la degeneración macular asociada con la edad o la retinopatia diabética.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para la producción de un anticuerpo anti-Factor D o un fragmento del mismo, que comprende cultivar la célula anfitriona de la invención en un medio; y purificar el anticuerpo o fragmento allí expresados.

En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo anti-Factor D o un fragmento del mismo obtenido mediante dicho método.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A y 1B representan la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable (Figura 1A) y la cadena ligera variable (Figura 1B) del MAb Murino 166-32.

Las Figuras 2A y 2B representan la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada variable (Figura 2A) y la cadena ligera variable (Figura 2B) del MAb Murino 166-32.

La Figura 3 representa la comparación de la cadena pesada del MAb murino 166-32.

La Figura 4 representa la comparación de la cadena ligera del MAb murino 166-32.

La Figura 5 representa las secuencias de aminoácidos de la Cadena Pesada Variable y la Cadena Ligera Variable para cada clon de humanizado anticuerpo Núm. 56, Núm. 111, Núm. 25 y Núm. 416.

La Figura 6 representa los resultados del análisis hemolftico para el clon del Fab de anticuerpo humanizado Núm. 56, Núm. 111, Núm. 25 y Núm. 416.

La Figura 7 representa la inhibición de la actividad del complemento alternativa por los clones del Fab de anticuerpo... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo ANTI-Factor D o un fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende:

(i) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 5 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 6.

(ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 7 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 8;

(iii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 9 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 1; o

(iv) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 11 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 12.

2. El anticuerpo anti-Factor D o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 1 que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 5 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 6.

3. El anticuerpo anti-Factor D o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 1 que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 7 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 8.

4. El anticuerpo anti-Factor D o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 1 que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 9 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 1.

5. El anticuerpo anti-Factor D o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 1 que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 11 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 97% con el SEQ ID NO: 12.

6. El anticuerpo anti-Factor D o un fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 3 que comprende el dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, en donde el aminoácido de la posición 14 del SEQ ID NO: 7 es una valina o una leucina.

7. El anticuerpo anti-Factor D o un fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la identidad de secuencia es de al menos 98%.

8. El anticuerpo anti-Factor D o un fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la identidad de secuencia es de al menos 99%.

9. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

1. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 9.

11. Una célula anfitriona que comprende el vector de la reivindicación 1.

12. Una composición que comprende el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

13. Una composición que comprende el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento de trastornos mediados por el complemento, en donde el trastorno es una enfermedad ocular tal como la degeneración macular relacionada con la edad o la retinopatía diabética.

14. Un método para la producción de un anticuerpo anti-Factor D o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende:

(i) cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 11 en un medio; y

(ii) purificar el anticuerpo o fragmento allí expresado.

15. Un anticuerpo anti-Factor D o un fragmento de unión a antígeno del mismo obtenido mediante el método de la reivindicación 14.