Anticuerpo frente al receptor opioide tipo Delta1a de Danio rerio.

Anticuerpo frente al receptor opioide tipo delta1a de danio rerio.

La presente invención proporciona anticuerpos, preferiblemente policlonales, específicos frente al receptor opioide tipo Delta1a de pez cebra, los cuales son capaces de reconocer dicho receptor específicamente sin presentar reactividad cruzada con otros tipos receptores opioides. Además, la invención proporciona un antígeno del receptor opioide tipo Delta1a de pez cebra empleado para la generación de dichos anticuerpos, así como un método de obtención de dichos anticuerpos y un kit que comprende dichos anticuerpos para la detección del receptor opioide tipo Delta1a de pez cebra.

3experimental para el estudio de los mecanismos que describen el dolor y la drogodependencia. La evolución de los receptores opioides en las especies analizadas, incluida el pez cebra, ocurre de manera paralela, y así, el receptor mu de pez cebra es homólogo al receptor mu de humano, rata y ratón, y los receptores tipo delta de pez cebra son homólogos al receptor delta de mamífero. En concreto, en los últimos años se han clonado cinco receptores de pez cebra semejantes a los 5 receptores opioides de mamíferos, a los que se ha denominado: ZFOR1 (del inglés, "Zebrafish Opioid Receptor 1") , actualmente llamado ZfDOR1, que presenta homología con el receptor opioide delta de mamíferos (Rodriguez et al., 2000, Neurosci Lett., 288 (3) :207-210) ; ZFOR2 (actualmente ZfMOR) , que presenta homología con el receptor opioide mu (Barrallo et al., 2000, Brain Res Mol Brain Res., 84 (1-2) :1-6) ; ZFOR3 (actualmente ZfKOR) , que presenta homología 10 con el receptor opioide kappa (Alvarez et al., 2006, Neurosci Lett., 405 (1-2) :94-99) ; ZFOR4 (actualmente ZfDOR2) , que es un duplicado de ZfDOR1 y, por ello, presenta mayor homología con el receptor opioide delta (Pinal- Seoane et al., 2006, J Mol Endocrinol., 37 (3) :391-403) y ZfORL, que presenta homología con el receptor ORL (Rivas- Boyero et al., 2011, J Mol Endocrinol.) . 15 El pez cebra (Danio rerio) , un teleósteo originario del río Ganghes, se utiliza como modelo experimental para estudiar el desarrollo embrionario de los vertebrados ya que presenta una serie de ventajas sobre otros organismos que son utilizados como modelos experimentales, siendo relativamente fácil el manejo de sus embriones y la realización de sondeos genéticos que revelan las etapas y mecanismos de la embriogénesis. 20 Se ha señalado que el pez cebra es un sistema adecuado para determinar la funcionalidad de proteínas codificadas por el genoma humano, así como para estudiar el desarrollo del sistema nervioso e identificar anomalías metabólicas. En los últimos años el pez cebra está siendo utilizado como organismo modelo para el descubrimiento y validación de nuevas dianas farmacológicas, así como en estudios toxicológicos y en la búsqueda de nuevas drogas. Varios 25 autores ya han propuesto al pez cebra como un modelo para el análisis biológico de los efectos de diversas drogas como el alcohol y la cocaína, obteniendo resultados parecidos a los encontrados en ratones. Anichtchik y colaboradores (Anichtchik et al., 2004, J Neurochem., 88 (2) :443-453) han demostrado que la administración de neurotoxinas catecolaminérgicas al pez cebra produce alteraciones neuroquímicas y comportamentales. Además, el pez cebra es un organismo en el que 30 se pueden realizar análisis químicos de moléculas de bajo peso molecular, evitando el efecto materno que puede alterar los resultados si el mismo análisis se realiza sobre animales con desarrollo intrauterino. Por ello, este modelo es adecuado para realizar ensayos preclínicos frente a agentes tóxicos, y puesto que los embriones modifican su comportamiento tras la ingesta de alcohol o cocaína, el pez cebra podría ser utilizado como modelo para el estudio del fenómeno de 35 adicción. Existen controversias sobre los mecanismos que subyacen a la aparición y el desarrollo de tolerancia y dependencia a drogas de abuso. Parece claro que es necesario desarrollar nuevos modelos que aporten información sobre estos desafortunados efectos secundarios desde el punto de vista molecular, estructural, celular y de comportamiento. En este sentido se han realizado 40 estudios sobre los efectos de la adicción a diferentes drogas utilizando el pez cebra como sistema modelo (Ninkovic y Bally-Cuif, 2006, Methods, 39 (3) :262-274) . El pez cebra puede ser un buen modelo para el estudio de los agentes opioides, ya que actualmente, 38 años después del descubrimiento de los opioides endógenos, se conocen mejor sus funciones, aunque no se han podido establecer con certeza absoluta los mecanismos 45 endógenos que describen su funcionamiento, ni se ha podido definir la forma de controlar los efectos secundarios producidos por éstos, como son la tolerancia y dependencia a las drogas. En concreto, es enorme la controversia existente en cuanto a los mecanismos intracelulares que hacen posible, por un lado, el control del dolor crónico y por otro, la producción de dependencia de 4la droga utilizada como agente analgésico. Hasta el momento, los estudios realizados con otros modelos experimentales no han resuelto muchas de las discrepancias existentes. Hasta el momento no se han generado anticuerpos contra los receptores opioides de pez cebra. Seguramente esto se debe a las dificultades que entraña la semejanza molecular entre los distintos subtipos de receptores opioides. Esta ausencia de herramientas en el estudio de los 5 receptores opioides en el pez cebra lleva a la necesidad de generar anticuerpos específicos contra los distintos receptores Mu, Delta1a y Delta1b que permitan profundizar en el conocimiento de sus funciones, que lleven a su vez a descubrir los mecanismos moleculares en los que estos agentes están involucrados. Las ventajas que presenta el uso del pez cebra como modelo de investigación se encuentran 10 limitadas por la escasa disponibilidad de anticuerpos que detecten las proteínas de este animal. Considerando que la conservación entre las secuencias de proteínas homólogas de pez cebra y mamíferos no es muy alta, hace que la gran cantidad de anticuerpos disponibles para la mayor parte de las proteínas de mamíferos no funcionen en las proteínas homólogas del pez cebra, lo que limita los estudios en este modelo. La generación de anticuerpos específicos contra cada uno 15 de los receptores opioides de pez cebra permitiría la realización de estudios que hasta el momento no han sido posibles. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona anticuerpos específicos frente al receptor opioide Delta1a de pez cebra, de ahora en adelante "anticuerpos de la invención", capaces de reconocer de forma 20 específica mediante, por ejemplo aunque sin limitarnos, técnicas de inmunohistoquímica, dicho receptor opioide. Además, los anticuerpos generados frente a este receptor son capaces de inmunoprecipitar la proteína correspondiente presente en lisados de embriones de pez cebra. El anticuerpo de la invención no produce reactividad cruzada contra los distintos receptores opioides, reconociendo únicamente el receptor opioide tipo Delta1a contra el que ha sido generado pero no 25 los otros miembros de esta familia de receptores. Por lo tanto, se proporcionan anticuerpos que reconocen específicamente el receptor opioide tipo Delta1a de pez cebra que pueden ser utilizados mediante distintas técnicas para diferentes estudios. La gran especificidad de los anticuerpos obtenidos permitirá estudiar las diferentes funciones en las que este receptor está implicado. 30 El antígeno utilizado para la generación de estos anticuerpos se localiza en el extremo carboxilo-terminal de la secuencia aminoacídica del receptor opioide tipo Delta1a de pez cebra, debido a que es la región más divergente entre los distintos receptores opioides. Por ello, un primer aspecto de la invención se refiere a un péptido aislado, de ahora en adelante "péptido de la invención", que consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1. Este péptido 35 corresponde a los últimos 35 aminoácidos del extremo C-terminal, residuos F339 a D373, del receptor opioide tipo Delta1a de pez cebra cuya secuencia aminoacídica se describe en la SEQ ID NO: 3. El péptido de la presente invención puede ser sintetizado, por ejemplo, aunque sin limitarnos, in vitro. Por ejemplo, mediante la síntesis de péptidos en fase sólida o mediante aproximaciones de 40 ADN recombinante. El péptido de la invención puede producirse recombinantemente, no sólo directamente sino como un polipéptido de fusión junto con un polipéptido heterólogo, el cual puede contener, por ejemplo aunque sin limitarnos, una secuencia señal o puede ser otro polipéptido, por ejemplo, aunque sin limitarnos GST (del inglés, "Glutathione S-transferase") , que facilite su aislamiento y purificación. Este polipéptido fusionado al péptido de la invención puede comprender 45 además un sitio de corte para una proteasa, por ejemplo, aunque sin limitarnos, en el extremo N-terminal de la proteína madura o del polipéptido. 5Debido a la degeneración del código genético, en el cual diversos tripletes de nucleótidos dan lugar a un mismo aminoácido, existen diversas secuencias de nucleótidos que dan lugar a una misma secuencia aminoacídica. Por ello, otro aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido aislado, de ahora en adelante "polinucleótido de la invención", que codifica para el péptido de la invención. 5 Los términos "secuencia nucleotídica", "secuencia... [Seguir leyendo]

151. Péptido aislado que consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1. 2. Polinucleótido aislado que codifica para el péptido según la reivindicación 1. 3. Polinucleótido según la reivindicación 2 que consiste en la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 2. 5 4. Construcción genética que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3. 5. Construcción genética según la reivindicación 4 que es un vector de expresión. 6. Célula que comprende la construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5. 7. Método de obtención de anticuerpos policlonales específicos frente al receptor opioide tipo 10 Delta1a de Danio rerio que comprende: a. obtener el suero previamente extraído de un mamífero inmunizado con el péptido según la reivindicación 1, y b. purificar los anticuerpos policlonales frente al receptor opioide tipo Delta1a de Danio rerio presentes en el suero obtenido en la etapa (a) . 15 8. Método según la reivindicación 7 donde el mamífero es un conejo. 9. Suero que comprende anticuerpos policlonales específicos frente al receptor opioide tipo Delta1a de Danio rerio obtenible por el método según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8. 10. Anticuerpo específico frente al péptido según la reivindicación 1. 11. Anticuerpo según la reivindicación 10, donde el anticuerpo es policlonal y ha sido obtenido 20 mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8. 12. Uso del suero según la reivindicación 9 o del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 para la detección del receptor opioide tipo Delta1a de Danio rerio. 13. Uso según la reivindicación 12, donde la detección del receptor opioide tipo Delta1a de Danio rerio se lleva a cabo mediante un ensayo inmunohistoquímico. 25 14. Uso según la reivindicación 13, donde el ensayo inmunohistoquímico se selecciona de la lista que consiste en: Western blot, ELISA o inmunofluorescencia. 15. Kit para la detección del receptor opioide tipo Delta1a de Danio rerio que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11. 16. Uso del kit según la reivindicación 15 para la detección del receptor opioide tipo Delta1a de 30 Danio rerio. 17. Método de detección del receptor opioide tipo Delta1a de Danio rerio que comprende: a. poner en contacto una muestra biológica aislada con el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, b. incubar la muestra biológica aislada y el anticuerpo del paso (a) durante un periodo de 35 tiempo adecuado para que tenga lugar una respuesta inmunológica, y c. determinar la presencia de respuesta inmunológica tras la incubación del paso (b) . 1618. Método según la reivindicación 17, donde la presencia de respuesta inmunológica en el paso (c) se determina mediante un ensayo inmunohistoquímico. 19. Método según la reivindicación 18, donde el ensayo inmunohistoquímico se selecciona de la lista que consiste en: Western blot, ELISA o inmunofluorescencia. 5