Alelos del gen mqo procedente de bacterias corineformes.

Mutantes aislados de bacterias corineformes, que contienen un gen,

escogido entre el conjunto que se compone de los siguientes a) hasta c):

a) un gen, que codifica un polipéptido con una actividad de malato-quinona oxidorreductasa, comprendiendo el polipéptido la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en cuyo caso está contenida L-fenilalanina en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y eventualmente está contenida L-serina en la posición 201 de la SEQ ID NO: 2;

b) un gen, que codifica un polipéptido con una actividad de malato-quinona oxidorreductasa, comprendiendo el polipéptido codificado una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en por lo menos un 98 % a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, estando contenida L-fenilalanina en la secuencia de aminoácidos en la posición, que corresponde a la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

c) un gen, que codifica una proteína con una actividad de malato-quinona oxidorreductasa, comprendiendo la proteína codificada una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6, inclusive de uno a 5 intercambio(s) conservativo(s) de aminoácidos, estando contenida L-fenilalanina en la secuencia de aminoácidos en la posición, que corresponde a la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

siendo aumentada en por lo menos un 0,5 % la segregación de aminoácidos de estos mutantes, en comparación con la de una cepa de partida no mutagenizada con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2.

Alelos del gen mqo procedente de bacterias corineformes Son objeto del invento unos mutantes y alelos del gen mqo procedente de bacterias corineformes, que codifican unas variantes de malato-quinona oxidorreductasa (EC: 1.1.99.16) y unos procedimientos para la producción de aminoácidos, en particular de L-lisina, triptófano y L-prolina, mediando utilización de unas bacterias, que contienen estos alelos.

Estado de la técnica Los aminoácidos encuentran uso en la medicina humana, en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y en particular en la nutrición de animales.

Es conocido que ciertos aminoácidos pueden ser producidos por fermentación de unas cepas de bacterias corineformes, en particular de Cor y nebacterium glutamicum. A causa de la gran importancia de este hecho, se está trabajando constantemente en el mejoramiento de los procedimientos de producción. Unos mejoramientos de los procedimientos pueden concernir a unas medidas técnicas de fermentación tales como por ejemplo la agitación y el abastecimiento con oxígeno, o a la composición de los medios nutritivos, tal como por ejemplo la concentración de azúcares durante la fermentación, o al tratamiento para dar la forma del producto mediante por ejemplo una cromatografía con intercambio de iones, o a las propiedades intrínsecas de rendimiento del microorganismo propiamente dicho.

Para el mejoramiento de las propiedades de rendimiento de estos microorganismos se utilizan unos métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen unas cepas, que son resistentes frente a unos antimetabolitos o que son auxótrofas para unos metabolitos importantes para regulación y que producen unos aminoácidos. Un antimetabolito conocido es el compuesto análogo a la lisina S- (2-aminoetil) -L-cisteína (AEC) .

Desde hace algunos años se emplean asimismo unos métodos de la técnica de ADN recombinante para el

mejoramiento de las cepas del género Cor y nebacterium que producen L-aminoácidos, mediante el recurso de que se amplifican unos genes individuales para la biosíntesis de aminoácidos, y se investiga la repercusión sobre la producción de aminoácidos. Una exposición recopilativa acerca los más diferentes aspectos de la genética, del metabolismo y de la biotecnología de Cor y nebacterium glutamicum se encuentra en la cita bibliográfica de Pühler ( (coordinador de edición) en Journal of Biotechnology 104 (1-3) , 1-338, 2003.

La secuencia de nucleótidos del gen que codifica la malato-quinona oxidorreductasa de Cor y nebacterium glutamicum fue determinada por Molenaar y colaboradores (European Journal of Biochemistr y 254 : 395 -403 (1998) y está disponible en el Banco de Datos del National Center for Biotechnology Information (Centro nacional para información de biotecnología) (NCBI) de la National Librar y of Medicine (Biblioteca nacional de medicina)

(Bethesda, MD, EE.UU.) bajo el número de acceso (en inglés accession number) AJ224946.

Ella puede ser deducida asimismo de la solicitud de patente internacional WO 01/00844 como la secuencia nº 569 y como la secuencia nº 571, así como de la solicitud de patente europea EP-A-1108790 como la secuencia nº 3478, la secuencia nº 7065 y como la secuencia nº 7066.

En el documento de patente europea EP1038969 se describe un mejoramiento de la producción por fermentación de L-aminoácidos por bacterias corineformes mediante el reforzamiento del gen mqo.

En el documento WO02086137 se describe, por el contrario, el efecto favorecedor del debilitamiento del gen mqo 50 sobre la producción de L-aminoácidos por bacterias corineformes. Una mutación del gen mqo, descrita en la solicitud, designada como "alelo 672", lleva el nucleótido adenina en lugar del nucleótido guanina en la posición 672 de la secuencia de ADN del gen mqo, lo que conduce a la formación de un codón de interrupción en la posición 224 de la secuencia de aminoácidos de la malato-quinona oxidorreductasa de Cor y nebacterium glutamicum. Asimismo, se describe el "alelo 1230", que contiene, adicionalmente a la mutación en el alelo 672, todavía una transición de 55 citosina a timina en la posición 1230 de la secuencia de nucleótidos del gen mqo. Además de ello, en esta solicitud se describe la desconexión del gen mqo mediante una interrupción del gen por medio de una mutagénesis por integración, que conduce a un aumento de la producción de L-lisina por la correspondiente cepa.

La biosíntesis microbiana de L-aminoácidos en bacterias corineformes es un complejo sistema y está enredada en 60 múltiples capas con otras diversas rutas metabólicas en la célula. Por lo tanto, no se puede realizar ninguna predicción acerca de si una desconexión total o una disminución de la actividad catalítica de malato-quinona oxidorreductasa en diferentes etapas mejoran a la producción de L-aminoácidos. Por lo tanto, es deseable poner a disposición también unas variantes de malato-quinona oxidorreductasa, que se diferencien en el grado de su actividad.

Para conseguir una mejor claridad, la secuencia de nucleótidos del gen mqo (de tipo silvestre) , que codifica la malato-quinona oxidorreductasa de Cor y nebacterium glutamicum, de acuerdo con los datos del banco de datos NCBI (acrónimo de National Center for Biotechnology Information = Centro nacional para información de biotecnología) se representa en la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de la malato-quinona oxidorreductasa, que se establece a partir de aquella, se representa en las SEQ ID NO: 2 y 4. En la SEQ ID NO: 3 se indican las secuencias de nucleótidos situadas corriente arriba (en inglés "upstream") y corriente abajo (en inglés "downstream”) .

Misión del invento Los autores del invento se han planteado la misión de poner a disposición nuevas medidas técnicas para la producción mejorada por fermentación de aminoácidos, en particular de L-lisina, L-triptófano y L-prolina.

Descripción del invento Son objeto del invento unos mutantes producidos o respectivamente aislados de bacterias corineformes, que segregan de manera preferida aminoácidos, y que contienen un gen o respectivamente un alelo, que se escoge entre uno de los siguientes a) hasta c) .

a) un gen, que codifica un polipéptido con una actividad de malato-quinona oxidorreductasa, caracterizado por que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en cuyo caso está contenida L-fenilalanina en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

b) un gen, que codifica un polipéptido con una actividad de malato-quinona oxidorreductasa, comprendiendo el polipéptido codificado una secuencia de aminoácidos que es idéntica en por lo menos un 98 % o en por lo menos un 99 % a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, estando contenida L-fenilalanina en la secuencia de aminoácidos en la posición que corresponde a la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

c) un gen, que codifica una proteína con una actividad de malato-quinona oxidorreductasa, comprendiendo la proteína codificada una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6 inclusive de uno a cinco, de manera preferida a lo sumo dos, a lo sumo tres o a lo sumo cuatro, intercambio (s) conservativo (s) de aminoácidos, estando contenida L-fenilalanina en la secuencia de aminoácidos en la posición que corresponde a la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

siendo aumentada la secreción de aminoácidos de estos mutantes en por lo menos un 0, 5 %, en comparación con la de una cepa de partida no mutagenizada con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, .

En el caso de las bacterias corineformes, se prefiere el género Cor y nebacterium. Se prefieren especialmente unas cepas que segregan aminoácidos, que se basan en las siguientes especies:

Cor y nebacterium efficiens tal como, por ejemplo, la cepa DSM44549,

Cor y nebacterium glutamicum tal como, por ejemplo, la cepa ATCC13032,

Cor y nebacterium thermoaminogenes tal como, por ejemplo, la cepa FERM BP-1539, y

Cor y nebacterium ammoniagenes tal como, por ejemplo, la cepa ATCC6871,

siendo muy especialmente preferida la especie Cor y nebacterium glutamicum.

Algunos representantes de la especie Cor y nebacterium glutamicum son conocidos en el estado de la técnica también por otras denominaciones de especies. A éstos pertenecen, por ejemplo:

Cor y nebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Cor y nebacterium lilium DSM20137 Cor y nebacterium melassecola ATCC17965 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y Brevibacterium divaricatum ATCC14020

Unos... [Seguir leyendo]

1. Mutantes aislados de bacterias corineformes, que contienen un gen, escogido entre el conjunto que se compone de los siguientes a) hasta c) :

a) un gen, que codifica un polipéptido con una actividad de malato-quinona oxidorreductasa, comprendiendo el polipéptido la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en cuyo caso está contenida L-fenilalanina en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y eventualmente está contenida L-serina en la posición 201 de la SEQ ID NO: 2;

b) un gen, que codifica un polipéptido con una actividad de malato-quinona oxidorreductasa, comprendiendo el polipéptido codificado una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en por lo menos un 98 % a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, estando contenida L-fenilalanina en la secuencia de aminoácidos en la posición, que corresponde a la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

c) un gen, que codifica una proteína con una actividad de malato-quinona oxidorreductasa, comprendiendo la proteína codificada una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6, inclusive de uno a 5 intercambio (s) conservativo (s) de aminoácidos, estando contenida L-fenilalanina en la secuencia de aminoácidos en la posición, que corresponde a la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

siendo aumentada en por lo menos un 0, 5 % la segregación de aminoácidos de estos mutantes, en comparación con la de una cepa de partida no mutagenizada con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2.

2. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizados por que en el caso de las bacterias corineformes se trata de una bacteria escogida entre el conjunto que se compone de Cor y nebacterium efficiens, Cor y nebacterium glutamicum, Cor y nebacterium thermoaminogenes y Cor y nebacterium aminogenes.

3. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizados por que se trata de Cor y nebacterium glutamicum.

4. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizados por que se trata de unas bacterias que segregan L-lisina o L-triptófano o L-prolina,

5. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizados por que el gen comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5.

6. Un polinucleótido aislado escogido entre uno de los siguientes a) o b)

a) un polinucleótido, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de malato-quinona oxidorreductasa y con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, que contiene L-fenilalanina en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y eventualmente posee L-serina en la posición 201 de la SEQ ID NO: 2.

b) un polinucleótido, comprendiendo la proteína codificada una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6 inclusive de uno a 5 intercambio (s) conservativo (s) de aminoácidos, estando contenida L-fenilalanina en la secuencia de aminoácidos, en la posición, que corresponde a la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

aumentando estos polinucleótidos en por lo menos un 0, 5 % la secreción de aminoácidos de los correspondientes mutantes, en comparación con la de una cepa de partida no mutagenizada, con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, .

7. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por que el polipéptido codificado con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 tiene una longitud de 500 aminoácidos, y está contenida L-fenilalanina en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

8. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado por que el polipéptido codificado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

9. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5.

10. Un polinucleótido aislado, que comprende una molécula de ácido nucleico, que codifica por lo menos un marco de lectura con una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 95 hasta 127 de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-fenilalanina en la posición correspondiente a la posición 111 de la SEQ ID NO: 2, para la utilización para la producción de unas bacterias corineformes, que tienen una segregación de aminoácidos

aumentada en por lo menos un 0, 5 % en comparación con la de la cepa de partida no mutagenizada, de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, .

11. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado por que comprende por lo menos la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 283 hasta 381 de la SEQ ID NO: 5.

12. Procedimiento para la producción de una bacteria corineforme recombinante, caracterizado por que

(a) un polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 6 hasta 9 o de acuerdo con las reivindicaciones 10 hasta 11 se transfiere a una bacteria corineforme,

(b) el gen de malato-quinona oxidorreductasa presente en el cromosoma de la bacteria corineforme, que codifica una secuencia de aminoácidos con L-serina en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, se intercambia por el polinucleótido procedente de a) , que codifica una secuencia de aminoácidos, que contiene Lfenilalanina en la posición 111 de la SEQ ID NO: 2 y eventualmente L-serina en la posición 201 de la SEQ ID NO: 2, y

(c) se multiplica y reproduce la bacteria corineforme obtenida de acuerdo con las etapas a) y b) .

13. Un vector, que contiene el polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 6 hasta 90 o 10 hasta 11.

14. Un microorganismo recombinante, que contiene el vector de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por que se trata de una bacteria corineforme.

15. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado por que en el caso de la bacteria corineforme se trata del género Cor y nebacterium.

16. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado por que en el caso de la bacteria del género Cor y nebacterium se trata de la especie Cor y nebacterium glutamicum.

17. Procedimiento para la producción de un L-aminoácido caracterizado por que, a) se fermenta una bacteria corinefrome aislada en un medio adecuado, conteniendo la bacteria un gen que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de malato-quinona oxidorreductasa, siendo reemplazada, en las secuencias de aminoácidos del polipéptido, la L-serina por L-fenilalanina en la posición 111 o en la correspondiente posición, y tratándose en el caso del gen de un polinucleótido de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 hasta 11, y b) el L-aminoácido se enriquece en el caldo de fermentación o en las células de la bacteria.

18. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado por que en el caso de la bacteria corineforme aislada se trata de un mutante de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 6.

19. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado por que se aísla o recoge el L-aminoácido.

20. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado por que se purifica el L-aminoácido.

21. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado por que el L-aminoácido se aísla o se recoge en común con unos componentes procedentes del caldo de fermentación y/o de la biomasa (> 0 hasta 100 %) .

22. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado por que a) a partir del caldo de fermentación obtenido a partir de la etapa b) de la reivindicación 17 se elimina la biomasa formada en una proporción de 0 a 100 %, y b) a partir del caldo obtenido en la etapa a) se produce un producto que está esencialmente seco y conformado, mediante un método escogido entre el conjunto que se compone de una granulación, una compactación, una desecación por atomización y una extrusión.

23. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado por que al caldo de fermentación, antes o después de la etapa a) , se le añade un ácido escogido entre el conjunto que se compone de ácido sulfúrico, ácido clorhídrico y ácido fosfórico.

24. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado por que a partir del caldo obtenido antes o después de la etapa a) , se elimina agua.

25. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado por que el producto conformado obtenido en o durante la etapa b) es rociado con un aceite.

Figura 1: Mapa del plásmido pK18mobsacB_mqoS111F