Aislamiento de células madre/progenitoras de membrana amniótica del cordón umbilical.

Un procedimiento de aislamiento de células madre/progenitoras epiteliales o mesenquimatosas de la membrana amniótica del cordón umbilical,

expresando las células madre/progenitoras epiteliales o mesenquimatosas el gen POU5f1 que codifica el factor de transcripción octámero-4 (Oct-4), comprendiendo el procedimiento:

(a) separar la membrana amniótica de los otros componentes del cordón umbilical aislado in vitro;

(b) cultivar el tejido de la membrana amniótica obtenido en la etapa (a) en un medio de cultivo en condiciones que permitan la proliferación celular; y

(c) aislar las células madre/progenitoras epiteliales o mesenquimatosas.

Aislamiento de células madre/progenitoras de membrana amniótica del cordón umbilical

La presente invención se refiere a un procedimiento de aislamiento de células madre/progenitoras epiteliales o mesenquimatosas de la membrana amniótica del cordón umbilical, en el que el procedimiento comprende separar la membrana amniótica de los otros componentes del cordón umbilical in vitro, cultivar el tejido de la membrana amniótica en condiciones que permiten la proliferación celular y aislar las células madre/progenitoras de los cultivos tisulares. La invención también se refiere al aislamiento y cultivo de tales células madre que tienen propiedades embrionarias en condiciones que permiten que las células experimenten expansión mitótica. Además, la invención se refiere a un procedimiento para la diferenciación de tales células madre/progenitoras aisladas y a los usos terapéuticos de estas células madre/progenitoras.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las células madre son una población de células que poseen las capacidades de auto-renovarse indefinidamente y de diferenciarse en múltiples células o tipos de tejido. Las células madre embrionarias (de aproximadamente los días 3 a 5 después de la fecundación) proliferan indefinidamente y pueden diferenciarse espontáneamente en todos los tipos de tejidos: así, estas se denominan células madre pluripotentes (revisado, por ejemplo, en Smith, A.G. (21) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 17, 435-462). Sin embargo, las células madre adultas son más específicas del tejido y pueden tener menos capacidad replicativa: así estas se denominan células madre multipotentes (revisado, por ejemplo, en Paul, G. y col. (21) Drug Discov. Today 7, 295-32). La plasticidad de las células madre embrionarias y adultas se basa en su capacidad para trans-diferenciarse en tejidos diferentes de su origen y quizás, a través de las capas germinales embrionarias.

La capacidad de las células madre para auto-renovarse es crítica para su función como depósito de células no diferenciadas primitivas. Por el contrario, la mayoría de las células somáticas tiene una capacidad limitada para la auto- renovación debido al acortamiento del telómero (revisado, por ejemplo, en Dice, J.F. (1993) Physiol. Rev. 73, 149-159). Así, las terapias basadas en células madre tienen la posibilidad de ser útiles para el tratamiento de una pluralidad de enfermedades humanas y animales.

Las células madre, además de las células madre/progenitoras, pueden derivarse de diferentes fuentes. Se ha caracterizado ampliamente el potencial de linajes múltiples de las células embrionarias madre y adultas. Aún cuando el potencial de las células madre es enorme, su uso implica muchos problemas éticos. Por lo tanto, se han propuesto las células madre no embrionarias derivadas del estroma de la médula ósea, el tejido adiposo, la dermis y sangre del cordón umbilical como fuentes alternativas. Estas células pueden diferenciarse, entre otras, en condrocitos, adipocitos, osteoblastos, mioblastos, cardiomiocitos, astrocitos y tenocitos in vitro y experimentar diferenciación in vivo, haciendo a estas células madre - en general denominadas células madre mesenquimatosas - prometedores candidatos para la reparación de defectos mesodérmicos y el tratamiento de enfermedades.

Sin embargo, en el uso clínico, la recogida de tales células madre mesenquimatosas provoca varios problemas. La recogida de las células es una carga mental y física para el paciente ya que se requiere un procedimiento quirúrgico para obtener las células (por ejemplo, la recogida de médula ósea es una táctica invasiva realizada con una aguja de biopsia que requiere anestesia local o incluso general). Además, en muchos casos, el número de células madre extraídas es más bien bajo. De manera más importante, las células no epiteliales se derivan o diferencian de estas células. Esto promovió la búsqueda para otras posibles fuentes de células madre.

La sangre del cordón umbilical se ha identificado como una fuente rica de células madre/progenitoras hematopoyéticas. Sin embargo, la existencia de células madre/progenitoras mesenquimatosas se ha tratado de manera controvertida. Por una parte, tales células no pudieron aislarse o se cultivaron exitosamente a partir de sangre del cordón umbilical a término (Mareschi, K y col., (21) Haematologica 86, 199-11). Al mismo tiempo, los resultados obtenidos por Campagnoli, C. y col. (Blood (21) 98, 2396-242), además de por Erices, A. y col. (Br: J. Haematol. (2) 19, 235-242) sugieren que las células madre mesenquimatosas están presentes en varios órganos fetales y circulan en la sangre de los fetos a pretérmino, simultáneamente con los precursores hematopoyéticos. En consecuencia, la solicitud de patente internacional WO 3/7922 desvela procedimientos de aislamiento y de expansión en cultivo de células madre/progenitoras mesenquimatosas de sangre del cordón umbilical y un procedimiento de diferenciación de tales células en varios tejidos mesenquimatosos. Se ha informado de eficiencias de aislamiento de aproximadamente el 6 % (Bieback, K. y col. (24) Stem Cells 22, 625-634). En el mismo estudio, se ha determinado que tanto el periodo de tiempo desde la recogida de la sangre del cordón umbilical hasta el aislamiento de las células y el volumen de la muestra de sangre usada son parámetros cruciales para lograr tal rendimiento. Sin embargo, todavía es un asunto de debate si estas células madre/progenitoras se derivan en verdad de tejido del cordón umbilical.

Recientemente, se ha aislado exitosamente células madre/progenitoras mesenquimatosas de tejido del cordón umbilical, concretamente de gelatina de Wharton, la matriz del cordón umbilical (Mitchel, K.E. y col. (23) Stem Cells 21, 5-6;

patente de Estados Unidos n.°: 5.919.72; solicitud de patente de Estados Unidos n.°: 24/136967). Se ha mostrado que estas células tienen la capacidad de diferenciarse, por ejemplo, en un fenotipo neuronal y en tejido cartilaginoso, respectivamente. Además, también se han aislado células madre/progenitoras mesenquimatosas del endotelio y la capa subendotelial de la vena del cordón umbilical, uno de los tres vasos (dos arterias, una vena) encontrados dentro del cordón umbilical (Romanov, Y.A. y col. (23) Stem Cells 21, 15-11; Covas, D.T. y col. (23) Braz. J. Med. Biol. Res. 36, 1179-1183). Finalmente, en la solicitud de patente europea EP 1 288 293, se han aislado células madre/progenitoras mesenquimatosas de la membrana amniótica de la placenta.

Sin embargo, ninguno de estos enfoques empleados hasta ahora ha producido el aislamiento o cultivo de células madre/progenitoras endoteliales como una fuente para terapias basadas en células epiteliales, tales como acondicionamiento superficial de la piel, reparación del hígado, manipulación por ingeniería tisular de la vejiga y otros tejidos superficiales manipulados por ingeniería. Así, existe todavía una necesidad de procedimientos y fuentes fidedignas, útiles para el aislamiento y cultivo de células madre/progenitoras epiteliales. Además, todavía se requieren procedimientos rápidos y eficientes que son éticamente aceptables y no imponen una carga biomédica sobre el paciente para el aislamiento de células madre/progenitoras epiteliales y mesenquimatosas con el fin de proporcionar tales células en una cantidad suficiente para diversas aplicaciones en medicina regenerativa y en ingeniería tisular.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un procedimiento de aislamiento de células madre/progenitoras epiteliales o mesenquimatosas de la membrana amniótica del cordón umbilical, expresando las células madre/progenitoras epiteliales o mesenquimatosas el gen POU5f1 que codifica el factor de transcripción octámero-4 (Oct-4), comprendiendo el procedimiento:

(a) separar la membrana amniótica de los otros componentes del cordón umbilical aislado in vitro\

(b) cultivar el tejido de la membrana amniótica obtenido en la etapa (a) en un medio de cultivo en condiciones que permitan la proliferación celular; y

(c) aislar las células madre/progenitoras epiteliales o mesenquimatosas.

En una realización, la invención proporciona un procedimiento, que comprende además:

(a") separar las células del tejido de la membrana amniótica antes del cultivo por una digestión enzimática o explante tisular directo.

En una realización preferida, la invención proporciona un procedimiento de aislamiento de células madre/progenitoras epiteliales o mesenquimatosas que tienen propiedades similares a células madre embrionarias.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento que comprende además:

(d) cultivar las células madre/progenitoras en un medio... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de aislamiento de células madre/progenitoras epiteliales o mesenquimatosas de la membrana amniótica del cordón umbilical, expresando las células madre/progenitoras epiteliales o mesenquimatosas el gen POU5f1 que codifica el factor de transcripción octámero-4 (Oct-4), comprendiendo el procedimiento:

(a) separar la membrana amniótica de los otros componentes del cordón umbilical aislado in v/'fro;

(b) cultivar el tejido de la membrana amniótica obtenido en la etapa (a) en un medio de cultivo en condiciones que permitan la proliferación celular; y

(c) aislar las células madre/progenitoras epiteliales o mesenquimatosas.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además:

(a") separar las células madre epiteliales o mesenquimatosas del tejido de la membrana amniótica antes del cultivo por digestión enzimática o explante tisular directo.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que las células madre/progenitoras epiteliales o mesenquimatosas tienen propiedades similares a las células madre embrionarias.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además:

(d) cultivar las células madre/progenitoras epiteliales o mesenquimatosas en un medio de cultivo en condiciones que permiten que las células experimenten expansión clónica.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, que comprende además:

(e) cultivar las células madre/progenitoras epiteliales o mesenquimatosas en un medio de cultivo en condiciones que permitan la diferenciación de dichas células en células epiteliales y/o células mesenquimatosas; y

(f) aislar las células diferenciadas.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que las células epiteliales están seleccionadas del grupo que consiste en: células epiteliales de la piel, células foliculares del pelo, células epiteliales de la córnea, células epiteliales de la conjuntiva, células epiteliales de la retina, células epiteliales del hígado, células epiteliales del riñón, células epiteliales pancreáticas, células epiteliales esofágicas, células epiteliales del intestino delgado, células epiteliales del intestino grueso, células epiteliales del pulmón, células epiteliales de las vías respiratorias, células epiteliales de la vejiga y células epiteliales uterinas.

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que las células mesenquimatosas están seleccionadas del grupo que consiste en: fibroblastos de la piel, condrocitos, osteoblastos, tenocitos, fibroblastos de ligamentos, cardiomiocitos, células del músculo liso, células del músculo esquelético, adipocitos, células derivadas de las glándulas endocrinas, células neuroectodérmicas y todas las variedades y derivados de las células neuroectodérmicas.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además:

(g) preservar las células madre/progenitoras aisladas para el uso posterior.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la preservación se lleva a cabo usando criopreservación.

1. Una célula madre/progenitora epitelial o mesenquimatosa aislada de la membrana amniótica del cordón umbilical por medio del procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 8-9.

11. Un banco de células que comprende una célula madre/progenitora epitelial o mesenquimatosa aislada por medio del procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 8-9.

12. Una composición farmacéutica que comprende una célula madre/progenitora según se define en la reivindicación 1.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 12, en la que la composición farmacéutica está adaptada para administración sistémica o tópica.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 12 o 13, en la que la composición farmacéutica adaptada para administración tópica está seleccionada del grupo que consiste en una pomada, una crema y una loción.

15. Una célula madre/progenitora según se define en la reivindicación 1 para tratar un sujeto que tiene un trastorno, en la que el trastorno está seleccionado del grupo que consiste en trastorno tisular, enfermedad neoplásica, enfermedad de la

piel, deficiencia endocrina visceral y un trastorno neural.

16. La célula madre/progenitora de la reivindicación 15, en la que el trastorno tisular es una deficiencia tisular congénita o adquirida.

17. La célula madre/progenitora de la reivindicación 15, en la que la deficiencia endocrina visceral está seleccionada del grupo que consiste en deficiencia de insulina, diabetes mellitus asociada a deficiencia de insulina, deficiencia de testosterona, anemia, hipoglucemia, hiperglucemia, deficiencia pancreática, deficiencia suprarrenal y anomalías tiroideas.

18. La célula madre/progenitora de la reivindicación 15, en la que el trastorno neural es enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedades de Lou Gehrig y enfermedad de Huntington.

19. La célula madre/progenitora de la reivindicación 15, en la que la enfermedad de la piel es envejecimiento acelerado o una herida.

2. La célula madre/progenitora de la reivindicación 15, en la que la enfermedad neoplásica es cáncer.

21. La célula madre/progenitora de la reivindicación 2, en la que el cáncer es uno seleccionado del grupo que consiste en carcinoma de células escamosas, carcinoma ductal y lobular de mama, carcinoma hepatocelular, carcinoma nasofaríngeo, cáncer de pulmón, cáncer de huesos, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o el cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer testicular, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer de próstata, leucemias crónicas o agudas, tumores sólidos de la Infancia, linfoma linfocítico, cáncer de vejiga, cáncer del riñón o del uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, anglogénesls tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma de la pituitaria, sarcoma de Kaposl, cáncer epldermolde, o cualquier combinación de tales cánceres, incluyendo formas diseminadas (en metástasis) de los mismos.

22. El uso de una célula madre/progenitora epitelial o mesenquimatosa de la reivindicación 1 para la producción de una molécula biológica.

23. El uso de la reivindicación 22, en el que la molécula biológica está seleccionada del grupo que consiste en una proteína, un péptido, una molécula orgánica pequeña, un oligosacárido, un polisacárido, un proteoglicano y un lípido.

24. El uso de una célula madre/progenitora epitelial o mesenquimatosa según se define en la reivindicación 1 como capa allmentadora en el cultivo de células de mamífero.

25. Un procedimiento in vitro de cultivo de células madre/progenitoras epiteliales o mesenqulmatosas de la reivindicación 1, que comprende:

obtener un explante tisular de la membrana amnlótlca aislada del cordón umbilical;

cultivar el explante tisular en medios de cultivo y condiciones de cultivo adecuadas durante un periodo de tiempo adecuado.

26. El procedimiento de la reivindicación 25, que comprende además exponer el explante tisular a medios de cultivo recién preparados y continuar el cultivo en condiciones adecuadas durante un periodo de tiempo adecuado.

27. El uso de medios de cultivo de células libres de suero para cultivar células madre mesenqulmatosas obtenidas mediante un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.