Vectores arenavíricos defectuosos en la replicación.

Partícula de arenavirus infeccioso incapaz de replicarse manipulada genéticamente para que contenga ungenoma con la capacidad de amplificar y expresar su información genética en las células infectadas con dichapartícula de arenavirus,

pero incapaz de producir más partículas infecciosas de progenie en células que nocomplementan, en donde en dicha partícula de arenavirus se han eliminado o inactivado funcionalmente uno o másde los cuatro marcos abiertos de lectura del arenavirus que codifican glucoproteína (GP), nucleoproteína (NP),proteína Z de la matriz y ARN polimerasa L dependiente de ARN de dicho genoma de dicha partícula de arenavirus.

Vectores arenavíricos defectuosos en la replicación

Campo de la invención La invención se refiere a arenavirus modificados genéticamente que son adecuados como vacunas o vectores para 5 terapia génica, y a procedimientos para utilizarlos en la vacunación y en el tratamiento de enfermedades.

Antecedentes de la invención Las vacunas preventivas representan uno de los capítulos más exitosos de la medicina moderna, que han conducido a la erradicación mundial de la viruela y al control de la polio, el sarampión y muchas otras enfermedades infecciosas devastadoras. Más recientemente empiezan a estar disponibles vacunas para prevenir el cáncer y se 10 está poniendo mucho empeño en conseguir explotar «vacunas» de una forma terapéutica, lo que alimenta las esperanzas de cara a infecciones y neoplasias malignas. Históricamente, las estrategias de vacunación han comprendido metodologías muy diferentes: tras comenzar con el uso de agentes infecciosos de tipo silvestre y la auto (rre) inoculación de las células tumorales, y luego seguir con agentes vivos atenuados y tejidos tumorales muertos, la medicina clínica se ha acercado con el tiempo cada vez más hacia el uso de proteínas (inertes) y/o otros 15 extractos (que se suelen denominar «antígeno») procedentes de agentes infecciosos o tumores, respectivamente. Este proceso gradual representa la búsqueda de una formulación de vacuna más segura, a menudo acompañada, sin embargo, por una relativa pérdida de la eficacia. En los últimos años, el avance de la ingeniería biológica ha hecho posible otra estrategia más que los investigadores colocan en la actualidad entre las más prometedoras: los agentes infecciosos que sirven de «transbordador» (llamado «vector») están equipados con un antígeno del

microorganismo patógeno o del tumor de elección. Por lo tanto, la respuesta inmunitaria del destinatario de la vacuna reconoce el antígeno de interés en un contexto que potencia enormemente la inmunidad («inmunógeno») que confiere el vector.

El «estrategia mediante vector» también ha permitido dirigir la introducción de genes foráneos en las células vivas a nivel de cultivo de tejidos, pero también en los organismos pluricelulares, entre ellos el hombre, y por lo tanto, los vectores se pueden explotar también para la expresión de genes en las células cultivadas o en la terapia génica.

En la actualidad, muchos vectores diferentes se encuentran en uso experimental, tanto para la vacunación como para la terapia génica, con el objetivo final de optimizar la eficacia y la seguridad para la aplicación clínica (vacunología y terapia génica) o para la biotecnología (transferencia génica en el cultivo de células) .

Resulta frecuente observar que los vectores tienden a compartir rasgos generales del organismo, p. ej., virus, de los cuales proceden. Por lo tanto, la explotación de una nueva familia de virus para el diseño de vectores promete una nueva combinación de rasgos que puede conferir este nuevo tipo de vector con capacidades sin precedentes y las aplicaciones correspondientes en la aplicación biomédica. Sin embargo, el diseño de vectores necesita tener en cuenta el perfil de seguridad del organismo utilizado y debe surgir con una estrategia que indique cómo eliminar la posible patogenia del organismo de una manera que no interfiera con los rasgos deseables, tal como la capacidad

inmunógena, para la administración como una vacuna.

Se sabe desde hace más de 70 años que los arenavirus en general y el virus de la coriomeningitis linfocítica (VCML) en particular desencadenan respuestas inmunitarias celular y humoral duraderas y extraordinariamente fuertes. Cabe destacar, sin embargo, que es mínima la inmunidad protectora mediante anticuerpos neutralizantes contra la glucoproteína (GP) de la envoltura del virus, lo que significa que la infección da lugar, en el mejor de los casos, a 40 una protección mínima mediada por anticuerpos contra la reinfección. También se ha establecido firmemente durante décadas que debido a su naturaleza no citolítica (que no destruye las células) , los arenavirus pueden, en determinadas condiciones, mantener la expresión del antígeno a largo plazo en los animales sin desencadenar la enfermedad. Recientemente se han descrito sistemas de genética inversa para manipular el genoma infeccioso de los arenavirus (L. Flatz, A. Bergthaler, J. C de la Torre, y D. D. Pinschewer, Proc. Natl. Acad Sci USA 103: 4663

4668, 2006; A. B. Sanchez y J. C. de la Torre, Virology, 350: 370, 2006) , pero hasta ahora los arenavirus no se han explotado como vectores para vacunación. Los mayores responsables son dos obstáculos importantes: i) los arenavirus pueden ocasionar una infección abrumadora que luego puede dar lugar a una enfermedad grave e inmunodepresión; ii) no se han podido incorporar antígenos foráneos de elección.

Compendio de la invención 50 La invención se refiere a una partícula infecciosa de arenavirus que se manipula genéticamente para que contenga un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su información genética en las células infectadas, pero que sea incapaz de producir una progenie de partículas infecciosas cuando se replica en las células normales sin manipulación genética.

Más específicamente, la invención se refiere a tales partículas de arenavirus que comprenden otros ácidos ribonucleicos que codifican proteínas de interés o que modulan la expresión génica del hospedador.

Un arenavirus de la invención comprende un genoma modificado, en donde i) se han eliminado o mutado uno o más de los cuatro marcos abiertos de lectura del arenavirus correspondientes a glucoproteína (GP) , nucleoproteína (NP) , proteína Z de la matriz y ARN polimerasa L dependiente de ARN para 5 impedir la propagación de la infectividad en las células normales, pero que todavía permite la expresión génica en tales células;

ii) se introducen ácidos ribonucleicos foráneos que codifican una o más proteínas o que modulan la expresión génica del hospedador y se transcriben desde uno o varios de los cuatro promotores del arenavirus en 5' UTR y 3' UTR del segmento S, y en 5' UTR y 3' UTR del segmento L, o de otros promotores introducidos que es capaz de leer la ARN

polimerasa vírica dependiente del ARN, o que es capaz de leer la ARN polimerasa I celular, ARN polimerasa II celular o ARN polimerasa III celular, respectivamente, y en donde los ácidos ribonucleicos que codifican las proteínas o que modulan la expresión génica del hospedador se transcriben por sí solos o por la lectura completa de una fusión con un marco abierto de lectura de una proteína del arenavirus; y opcionalmente iii) en la secuencia del transcrito vírico se introducen uno o más sitios internos de entrada del ribosoma para reforzar 15 la expresión de proteínas en la célula infectada por el arenavirus.

La invención se refiere adicionalmente a vacunas y preparaciones farmacéuticas que comprenden tales arenavirus manipulados genéticamente, y a los procedimientos de vacunación y la terapia génica que utiliza estos arenavirus manipulados genéticamente.

La invención se refiere adicionalmente a la expresión de una proteína de interés en un cultivo celular o a la modulación de la expresión génica en un cultivo celular, en donde el cultivo celular está infectado con arenavirus manipulados genéticamente.

Breve descripción de las figuras Figura 1

Debido a los cambios hechos al genoma del arenavirus de tipo silvestre, los vectores arenavíricos derivados se 25 replican sólo en las células para complementación.

A: los vectores arenavíricos (1) pueden infectar las células normales (2) o las células para complementación (células-C, 3) . Tras la infección de las células-C se forma una progenie adicional de vectores infecciosos, mientras que la infección de las células normales o bien no produce ninguna partícula de vector o bien produce partículas no infecciosas.

B: las células-C (1) y las células normales (2) se infectaron con un vector basado en el VCML (rVCML/GFP) que expresa la proteína fluorescente verde (GFP, por su nombre en inglés) en vez de VCML-GP, y muestras de sobrenadante recogido en distintos puntos temporales (3, dados en horas) . La infectividad del sobrenadante (4, dada como UFP/ml) se determinó en un ensayo de formación de focos.

C: el genoma del arenavirus de tipo silvestre consiste en un segmento grande (L, 1) y uno pequeño (S; 2) . El

segmento L expresa los genes de L (3) y Z (4) , mientras que el segmento S lleva los genes de NP (5) y GP (6) . Una estrategia para generar un vector arenavírico incapaz de replicarse puede ser la sustitución del gen... [Seguir leyendo]

1. Partícula de arenavirus infeccioso incapaz de replicarse manipulada genéticamente para que contenga un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su información genética en las células infectadas con dicha partícula de arenavirus, pero incapaz de producir más partículas infecciosas de progenie en células que no complementan, en donde en dicha partícula de arenavirus se han eliminado o inactivado funcionalmente uno o más de los cuatro marcos abiertos de lectura del arenavirus que codifican glucoproteína (GP) , nucleoproteína (NP) , proteína Z de la matriz y ARN polimerasa L dependiente de ARN de dicho genoma de dicha partícula de arenavirus.

2. Partícula de arenavirus incapaz de replicarse de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende secuencias de ácido nucleico adicionales que codifican una proteína o péptido de interés.

3. Partícula de arenavirus incapaz de replicarse de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende secuencias de ácido nucleico adicionales que modulan la expresión génica del hospedador.

4. Partícula de arenavirus incapaz de replicarse de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en donde el genoma está modificado adicionalmente para i) expresar secuencias de ácido ribonucleico foráneo que codifican una o varias proteínas de interés o adecuadas para modular la expresión génica del hospedador bajo el control de uno o más de los cuatro promotores de arenavirus e.

5. UTR .

3. UTR del segmento S, y e.

5. UTR .

3. UTR del segmento L, y/o bajo el control de elementos reguladores que pueden ser leídos por la ARN polimerasa vírica dependiente de ARN, por la ARN polimerasa I celular, por la ARN polimerasa II celular o por la ARN polimerasa III celular, en donde las secuencias de ácido ribonucleico foráneo se expresan bien por sí mismas o bien como producto de la lectura completa de una fusión con los marcos abiertos de lectura de las proteínas de arenavirus; y opcionalmente ii) comprender uno o varios sitios internos de entrada del ribosoma para incrementar la expresión de las proteínas de interés en la célula infectada por el vector arenavírico.

5. Partícula de arenavirus incapaz de replicarse de acuerdo con la reivindicación 4, en donde se ha eliminado o se ha inactivado funcionalmente el marco abierto de lectura que codifica la glucoproteína (GP) .

6. Partícula de arenavirus incapaz de replicarse de acuerdo con la reivindicación 5, en donde se ha eliminado el marco abierto de lectura del arenavirus que codifica la glucoproteína (GP) y ha sido reemplazado por la secuencia de ácido ribonucleico foráneo que codifica una o varias proteínas de interés o que modulan la expresión génica del hospedador.

7. Partícula de arenavirus incapaz de replicarse de acuerdo con la reivindicación 5, en donde se ha eliminado el

marco abierto de lectura del arenavirus que codifica la glucoproteína (GP) y se ha reemplazado por la secuencia de ácido ribonucleico foráneo que codifica antígenos peptídicos o proteicos procedentes de organismos infecciosos, de tumores o de alérgenos.

8. Partícula de arenavirus incapaz de replicarse de acuerdo con la reivindicación 5, en donde se ha eliminado el marco abierto de lectura del arenavirus que codifica la glucoproteína (GP) y se ha reemplazado por la secuencia de ácido ribonucleico foráneo seleccionada de ARN ahorquillado pequeño (shRNA) , ARN pequeño interferente (siRNA) y microARN (miRNA) .

9. Partícula de arenavirus incapaz de replicarse de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el arenavirus es el virus de la coriomeningitis linfocítica (VCML) .

10. Partícula de arenavirus incapaz de replicarse de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende ácidos

ribonucleicos foráneos que codifican un antígeno seleccionado de antígenos del virus sincitial respiratorio, antígenos del virus de la inmunodeficiencia humana, antígenos del virus de la hepatitis C, antígenos del virus de la varicela zóster, antígenos del virus del herpes simple, antígenos del citomegalovirus y antígenos procedentes de Mycobacterium tuberculosis.

11. Vacuna que comprende una partícula de arenavirus incapaz de replicarse de acuerdo con cualquiera de las 45 reivindicaciones 2 a 10.

12. Preparación farmacéutica que comprende una partícula de arenavirus incapaz de replicarse de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10.

13. Uso de una partícula de arenavirus incapaz de replicarse de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2

a 10, para la fabricación de un fármaco para la prevención de infecciones por virus, bacterias, parásitos y priones, de 50 enfermedades neoplásicas o de enfermedades degenerativas.

14. Partícula de arenavirus incapaz de replicarse de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, para

el uso en un procedimiento para la prevención de infecciones por virus, bacterias, parásitos y priones, enfermedades neoplásicas o enfermedades degenerativas.

15. Utilización de una partícula de arenavirus incapaz de replicarse de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, para la fabricación de un fármaco para el tratamiento de infecciones ocasionadas por virus,

bacterias, parásitos y priones, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades neoplásicas, enfermedades metabólicas, enfermedades degenerativas, enfermedades hereditarias, enfermedades alérgicas o toxicomanías.

16. Partícula de arenavirus incapaz de replicarse de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, para el uso en el tratamiento de infecciones ocasionadas por virus, bacterias, parásitos y priones, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades neoplásicas, enfermedades metabólicas, enfermedades degenerativas,

enfermedades hereditarias, enfermedades alérgicas o dependencias.

17. Procedimiento para expresar una proteína de interés o modificar la expresión génica en un cultivo celular, en donde el cultivo celular está infectado con una partícula de arenavirus incapaz de replicarse de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10.

18. Procedimiento para modificar la expresión génica en un cultivo celular, en donde el cultivo celular está

infectado con una partícula de arenavirus incapaz de replicarse de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10.