Variantes de cadena beta de HGF.

Molécula antagonista de HGF/C-Met que comprende un mutante de HGF que comprende una mutación en lacadena b de HGF en la posición V495,

G498, R502 más T503, o D672, en la que la mutación en la cadena b deHGF impide la inserción del extremo N terminal de la cadena b de HGF en un bolsillo de unión a HGF, y en la que elmutante de HGF resultante presenta una función biológica reducida en comparación con el HGF de tipo natural.

Variantes de cadena beta de HGF

CAMPO TECNlCO [0001] La presente invencion se refiere generalmente a los campos de la biologia molecular y la regulacion del factor de crecimiento. Mas especificamente, la presente invencion se refiere a moduladores de la ruta de senalizacion de HFG/c-met y a usos de dichos moduladores. ANTECEDENTES [0002] El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , tambien conocido como factor dispersor (SF) , es el ligando para Met (Bottaro et al., 1991) , una tirosina quinasa receptora codificada por el protooncogen c-met (Cooper et al.,

1984a &b) . La union de HGF a Met induce la fosforilacion del dominio quinasa intracelular que da como resultado la activacion de una compleja serie de rutas intracelulares que conducen al crecimiento, diferenciacion y migracion celular en diversos tipos de celulas; varios estudios publicados recientemente proporcionan una exhaustiva vision global (Birchmeier et al., 2003; Trusolino y Comoglio, 2002; Maulik et al., 2002) . Ademas de su importancia fundamental en el desarrollo embrionario y regeneracion tisular, la ruta de senalizacion de HGF/Met tambien estaba implicada en el crecimiento tumoral invasivo y metastasis y, por tanto, representa una diana terapeutica interesante (Birchmeier et al., 2003; Trusolino y Comoglio, 2002; Danilkovitch-Miagkova y Zbar, 2002; Ma et al., 2003) . [0003] HGF pertenece a la familia de factores de crecimiento relacionados con plasminogeno y comprende una cadena α de 69 kDa que contiene el dominio del dedo N-terminal (N) y cuatro dominios de Kringle (K1-K4) , y una cadena β de 34 kDa que tiene una gran similitud con dominios de proteasas de serina proteasas similares a quimotripsina del Clan PA (S) /FamiliaS1 (Nakamura et al., 1989; Donate et al., 1994; Rawlings et al., 2002) . Al igual que el plasminogeno y otros zimogenos de serina proteasa, el HGF se secreta en forma precursora de cadena sencilla (scHGF) . scHGF se une a proteoglicanos de heparan sulfato, tales como sindecan-1 (Derksen et al., 2002) en superficies celulares o en la matriz extracelular. Los proteoglicanos de heparan sulfato se unen al dominio N (Hartmann et al., 1998) , que tambien contribuye a la union de Met de alta afinidad junto con aminoacidos situados en K1 (Lokker et al., 1994) . Aunque scHGF es capaz de unirse a Met con alta afinidad, no puede activar al receptor (Lokker et al., 1992; Hartmann et al., 1992) . La adquisicion de la actividad de senalizacion de HGF depende de la escision proteolitica (activacion) de scHGF en Arg494-Val495 que da como resultado la formacion de HGF maduro, un heterodimero α/β unido mediante puentes disulfuro (Lokker et al., 1992; Hartmann et al., 1992; Naldini et al.,

1992) . El dominio de tipo proteasa de HGF (cadena º de HGF) esta desprovisto de actividad catalitica ya que carece de la triada catalitica requerida Asp [c102]-His [c57]-Ser [c195] (numeracion estandar de quimiotripsinogeno en parentesis) hallada en todas las serina proteasas (Perona y Craik, 1995; Hedstrom, 2002) , que tiene una Gln534 [c57] y Tyr673 [c195]. [0004] Debido a su importancia en la regulacion de la actividad de HGF, este proceso debe estar controlado estrechamente por enzimas convertidoras de HGF y sus inhibidores fisiologicos correspondientes. La activacion de scHGF se mide in vitro por serina proteasas similares a quimotripsina, incluyendo el activador del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFA) (Miyazawa et al., 1993) , matriptasa/MT-SP1 (Takeuchi et al. 1999; Lin et al., 1999) , el activador de plasminogeno de tipo uroquinasa (Naldini et al., 1992) , factor Xlla (Shimomura et al., 1995) ,

factor Xla (Peek et al., 2002) y kalikreina plasmatica (Peek et al., 2002) . Similares a scHGF, estas proteasas se producen en forma de precursores inactivos; sus actividades enzimaticas tambien estan fuertemente reguladas por otras proteasas de activacion e inhibidores tanto de tipo Kunitz como de tipo serpina. [0005] Se han descrito las serina proteasas y su proceso de activacion (Donate et al., 1994) . En las serina proteasas, la escision de activacion del zimogeno produce una reordenacion conformacional del denominado "dominio de activacion" dando origen a un punto activo formado adecuadamente y la region de interaccion sustrato/inhibidor. El dominio de activacion constituye tres bucles expuestos a la superficie llamados bucles [c140], [c180] y [c220] y la insercion del extremo N terminal recien formado en un bolsillo hidrofobico (Huber y Bode, 1978) . En la proteina homologa estimuladora de macrofagos del par ligando/receptor (MSP) /Ron, la cadena β de MSP

similar a serina proteasa proporciona la energia principal para la union al receptor (Wang et al., 1997; Miller y Leonard, 1998) . Esto se invierte a partir del sistema HGF/Met, donde el punto de union al receptor de alta afinidad para Met esta en la cadena α de HGF (Lokker, et al., 1994; Okigaki et al., 1992) . [0006] La importancia del eje de senalizacion de HGF/Met en la funcion celular normal y en la etiologia de trastornos clinicos sugiere la necesidad de desarrollar medios terapeuticos altamente efectivos basados en la modulacion de este eje. La complejidad de esta ruta, sin embargo, particularmente a la luz del mecanismo poco entendido de las interacciones de HGF-HGF y HGF/Met, ha progresado lentamente en este frente y ha destacado la necesidad de desarrollar estrategias que se basen en un mejor entendimiento del mecanismo de accion de las interacciones de HGF-HGF y HGF/Met. La invencion descrita aqui a continuacion satisface esta necesidad y proporciona otras 65 ventajas.

DESCRlPClON DE LA lNVENClON

El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , un factor de crecimiento relacionado con plasminogeno, se une a su Met de tirosina quinasa receptora (tambien referida en este documento como C-Met, c-Met o c-met) , que esta implicada en el desarrollo, regeneracion tisular y crecimiento tumoral invasivo. La propia cadena de HGF de tipo serina proteasa se une a Met. A parte de unirse a Met, no esta claro que regiones y residuos especificos en la cadena de HGF son necesarios para realizar la senalizacion adecuada a traves de la ruta de HGF/Met. Los presentes inventores predijeron que ciertas regiones/posiciones en la cadena contribuyen de manera importante a una actividad funcional correcta de HGF, donde estas contribuciones pueden implicar o no la union de la cadena de HGF a su receptor afin. Los resultados descritos en el presente documento aportan evidencias de que mutaciones en la region N terminal y/o la region de dimerizacion de la cadena de HGF pueden alterar la funcion biologica de HGF/Met, con o sin impedir sustancialmente la union de HGF (en particular la cadena de HGF) a c-Met- En general, pero no necesariamente, estas mutaciones no implican posiciones pensadas para comprender el "dominio de activacion" o "la region del sitio activo" del HGF de tipo natural.

Los analisis de mutacion descritos en este documento proporcionan una base para el diseno de una multitud de mutantes de HGF capaces de inhibir las interacciones de HGF/HGF de tipo natural y HGF/c-met en un espectro de potencias. Los ejemplos de dichos mutantes se describen en este documento. Estos mutantes son capaces de competir con HGF de tipo natural por la union a c-met, aunque muestran una capacidad reducida para realizar las funciones biologicas asociadas a c-met. Esto es particularmente ventajoso cuando la inhibicion completa o sustancial del eje HGF/c-met es indeseable; esto es particularmente importante puesto que HGF y c-met se expresan de forma ubicua en celulas y tejidos normales. Estos mutantes tambien pueden usarse como agentes terapeuticos ventajosos para tratar afecciones patologicas en las que la actividad biologica reducida, pero no su completa ausencia, de HGF/c-met es deseable. Los metodos y composiciones de la invencion se basan, como minimo en parte, en estos hallazgos que se describen con mas detalles a continuacion.

En un aspecto, la presente invencion proporciona una molecula antagonista de HGF/C-Met que comprende un mutante de HGF que comprende una mutacion en la region N terminal de la cadena de HGF tal como se define en las reivindicaciones.

Una mutacion en la region N terminal de la cadena de HGF puede ser cualquiera que impida la insercion del extremo N terminal de la cadena de HGF en un bolsillo de union de HGF. En una realizacion, el mutante de la cadena de HGF resultante se une a C-Met con una afinidad de union reducida en comparacion con la cadena de HGF de tipo natural. En una realizacion, el mutante de la cadena de HGF resultante se une a C-Met con una afinidad sustancialmente equivalente a la cadena de HGF de tipo natural. En una realizacion, el HGF de longitud completa resultante que contiene una cadena º de HGF mutada, se une a C-Met con una afinidad de union reducida... [Seguir leyendo]

1. Molecula antagonista de HGF/C-Met que comprende un mutante de HGF que comprende una mutacion en la cadena β de HGF en la posicion V495, G498, R502 mas T503, o D672, en la que la mutacion en la cadena β de HGF impide la insercion del extremo N terminal de la cadena β de HGF en un bolsillo de union a HGF, y en la que el mutante de HGF resultante presenta una funcion biologica reducida en comparacion con el HGF de tipo natural.

2. Molecula antagonista, segun la reivindicacion 1, en la que la funcion biologica es la proliferacion celular, la migracion celular, la fosforilacion de Met o la angiogenesis.

3. Molecula antagonista, segun la reivindicacion 1 o 2, en la que el mutante de HGF resultante se une a C-Met con una afinidad de union sustancialmente reducida en comparacion con el HGF de tipo natural.

4. Molecula antagonista, segun la reivindicacion 1 o 2, en la que el mutante de HGF resultante se une a C-met con una afinidad sustancialmente equivalente a la del HGF de tipo natural.

5. Molecula antagonista, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la mutacion en la cadena β de HGF es V495G, V495A, G498l, G498P, G498V, R502del mas T503del, o D672N.

6. Molecula antagonista, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la molecula comprende aminoacidos de tipo natural en las posiciones 534, 578, 619, 673, 692, 693, 694, 695, 696, 699 y/o 702.

7. Molecula antagonista, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la molecula presenta una capacidad de senalizacion de C-met reducida en comparacion con el HGF de tipo natural.

8. Molecula antagonista, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la molecula presenta una capacidad reducida para estimular la migracion celular en comparacion con el HGF de tipo natural.

9. Molecula antagonista, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la molecula presenta una capacidad reducida para estimular la proliferacion celular en comparacion con el HGF de tipo natural.

10. Molecula antagonista, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la molecula presenta una capacidad reducida para estimular la angiogenesis en comparacion con el HGF de tipo natural.

11. Molecula antagonista de HGF/c-met, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para utilizar en un metodo de reduccion de la activacion de c-Met en un sujeto.

12. Molecula antagonista para utilizar, segun la reivindicacion 11, para reducir la proliferacion de una celula en un sujeto.

13. Molecula antagonista para utilizar, segun la reivindicacion 11, para reducir la migracion de una celula en un sujeto.

14. Molecula antagonista para utilizar, segun la reivindicacion 11, para reducir la actividad angiogenica de una celula en un sujeto.

15. Molecula antagonista de HGF/c-met, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para utilizar en un metodo de tratamiento de una afeccion patologica asociada con la activacion de c-Met en un sujeto.

16. Molecula antagonista para utilizar, segun la reivindicacion 15, en la que la afeccion patologica es cancer.

17. Utilizacion de una molecula antagonista de HGF/c-Met, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de una afeccion patologica asociada con la activacion de c-Met en un sujeto, en la que la afeccion patologica es cancer.

18. Acido nucleico que codifica la molecula antagonista de HGF/c-Met, segun cualquiera de las reivindicaciones 1

10.

19. Celula huesped, que comprende el acido nucleico segun la reivindicacion 18.

20. Articulo de fabricacion que comprende un recipiente que comprende una o mas moleculas antagonista de HGF/c-Met segun cualquiera de las reivindicaciones 1-10.

21. Metodo de produccion de la molecula antagonista de HGF/c-Met, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-10, comprendiendo dicho metodo expresar en una celula huesped un acido nucleico que codifica la molecula antagonista, y recuperar la molecula antagonista de la celula.

Figura 1A

Figura 1B

Union de mutantes de HGF de longitud completa a Met en un ensayo de union de competicion Mutante de HGF Union de competicion HGF/Met [numeracion de quimiotripsinogeno] lC50 (mut) /lC50 (wt) WT 1 V495A [c16] 0, 8 ± 0, 1 V495G [c16] 1, 7 ± 0, 1 V495del [c16del] 0, 7 ± 0, 2 D672N [c194] 2, 0 ± 0, 8 G498A [c19] 0, 7 ± 0, 2 G498l [c19] 1, 1 ± 0, 5 G498P [c19] 1, 1 ± 0, 2 G498V [c19] 1, 3 ± 0, 4 Figura 1C

lnhibicion de la migracion de celulas MDA-MB435 y la proliferacion de BxPC3 por mutantes de HGF de longitud completa (n = 4)

Mutante de HGF Migracion de MDA-MB435 Proliferacion de BxPC3

HGFmut 200 nM HGFmut 20 nM HGFmut 200 nM

% de control ± SD % de control ± SD % de control ± SD

V495G 28, 0 ± 19, 5 63, 4 ± 15, 5 -5, 3 ± 6, 6

D672N 26, 0 ± 7, 4 57, 4 ± 14, 1 4, 4 ± 9, 3

G498l 21, 1 ± 17, 6 38, 5 ± 20, 7 -12, 0 ± 11, 2

scHGF 15, 2 ± 6, 1 46, 5 (n = 2) 9, 3 (n = 2)

Figura 2A Figura 2B Figura 3A Figura 3B Figura 4