Vacunas contra la malaria.

Una proteína de fusión híbrida inmunógena que comprende:

a.

al menos una unidad de repetición derivada de la región de repetición de una proteína decircumsporozoito de tipo I de P. vivax,

b. al menos una unidad de repetición derivada de la región de repetición de una proteína decircumsporozoito de tipo II de P. vivax. y

c. antígeno S de superficie derivado del virus de Hepatitis B.

Vacunas contra la malaria La presente invención se refiere a una proteína novedosa híbrida/de fusión, procedimientos para preparar y purificar la misma, su uso en medicina, particularmente en la prevención de infecciones de malaria, por ejemplo las provocadas por Plasmodium vivax (P. vivax) , las composiciones/vacunas que contienen la proteína y el uso de las mismas, particularmente en terapia. La invención también se extiende a partículas lipoproteica de dicha proteína híbrida/de fusión y a formulaciones/vacunas que comprenden la misma y su uso.

La malaria es uno de los principales problemas de salud en el mundo con más de 2 a 4 millones de personas muriendo de la enfermedad cada año. Una de las formas más corrientes de la enfermedad está provocada por el parásito protozoo P. vivax, que se encuentra en las regiones tropicales y sub-tropicales. De manera interesante el parásito puede completar su ciclo en el mosquito a temperaturas tan bajas como 15 grados Celsius, lo que ha permitido que la enfermedad se extienda en climas templados.

El ciclo de vida de P. vivax es complejo, requiriendo dos huéspedes, hombre y mosquito para la finalización. La infección del hombre se inicia mediante la introducción de esporozoitos en la saliva de un mosquito infectado. Los esporozoitos migran al hígado y allí infectan los hepatocitos donde se diferencian, mediante la fase intracelular fuera de los eritrocitos, en la fase merozoito que infecta los glóbulos rojos (RBC) para iniciar la replicación cíclica en la fase de sangre asexual. El ciclo se completa mediante la diferenciación de un número de merozoitos en los RBC en los gametocitos de fase sexual que se ingieren por el mosquito, donde se desarrollan mediante una serie de fases en el intestino medio para producir esporozoitos que migran a la glándula salivar.

Debido al hecho de que la enfermedad provocada por P. vivax es raramente letal, se han centrado esfuerzos para evitar y tratar malaria en la forma más mortal de la enfermedad provocada por Plasmodium falciparum (P. falciparum) .

Aunque la enfermedad provocada por P. vivax usualmente no da como resultado la muerte del paciente, debido al volumen de casos, que parece que se incrementa, el impacto significativo sobre la calidad de la vida del paciente, las reseñas crecientes de las graves incidencias de la enfermedad que dan como resultado anemia y muerte y el impacto económico, se requiere todavía una vacunación eficaz para la enfermedad.

Una característica de P. vivax es que algunas cepas son capaces de provocar infección retrasada permaneciendo latentes en el hígado antes de emerger en la circulación periférica para manifestar síntomas clínicos. De este modo los individuos, por ejemplo cuando viajan a través de un área infectada, se pueden infectar y aún no mostrar los síntomas durante varios meses. Esto tiene el potencial para provocar la extensión de la enfermedad y por esta razón a las personas que viajan a áreas infectadas no se les permite donar sangre para transfusión durante un período definido de tiempo después de viajar a la región infectada.

La infección de malaria por P. vivax permanece latente dentro del hígado mientras que el parásito experimenta esquizogonia pre-eritrocítica. Si el parásito está controlado en esta fase antes de que se escape del hígado no se observan síntomas clínicos de la enfermedad en el paciente.

La fase esporozoito de P. vivax se ha identificado como una diana potencial de una vacuna de malaria. Se ha mostrado que la vacunación con esporozoito desactivado (irradiado) induce protección contra la malaria humana experimental (Am. J. Trop. Med. Hyg. 24: 297-402, 1975) . Sin embargo, no ha sido posible práctica y logísticamente fabricar una vacuna para malaria para la población general basada en esta metodología, empleando esporozoitos irradiados.

La proteína de superficie principal del esporozoito se conoce como proteína de circumsporozoitos (proteína CS) . Se cree que está implicada en la movilidad e invasión del esporozoito durante su paso desde el sitio inicial de inoculación por el mosquito en la circulación, donde migra al hígado.

La proteína CS de las especies de Plasmodio se caracteriza por un dominio repetitivo central (región de repetición) flanqueado por fragmentos amino (extremo N-terminal) y carboxi (extremo C-terminal) no repetitivos. El dominio central de P. vivax está compuesto por varios bloques de una unidad de repetición, en general de nueve aminoácidos en tándem.

En ciertas cepas asiáticas, después de la región de repetición central, está presente una secuencia adicional de aproximadamente 12 aminoácidos (véase la SEC ID N.º 11) . La función de esta última es desconocida. Sin embargo, se propone la hipótesis por algunos de que dichos aminoácidos pueden estar asociados a la aparición retrasada de los síntomas clínicos de la enfermedad, aunque esto no se ha investigado. Se cree que el extremo Nterminal se caracteriza por una secuencia de 5 aminoácidos conocida como región I (véase la SEC ID N.º 1) . También se cree que el extremo C-terminal se caracteriza por comprender una secuencia de 18 aminoácidos conocida como región II. Esta última contiene un motivo adhesivo a célula, que está altamente conservado entre todas las proteínas CS de malaria (véase la SEC ID N.º 2) .

Varios grupos han propuesto vacunas de subunidades basadas en la proteína de circumsporozoito. Dos de estas vacunas han experimentado ensayo clínico; una es un péptido sintético, la otra es una proteína recombinante (Ballou y col., Lancet: i 1277 (1987) y Herrington y col., Nature 328: 257 (1987) ) . Estas vacunas eran exitosas en la estimulación de una respuesta anti-esporozoita. Sin embargo, la magnitud de la respuesta era decepcionante, no teniendo algunas vacunas ninguna respuesta en absoluto. Además, la ausencia de “reinmunización” de niveles de anticuerpo en inyecciones posteriores y los resultados de los ensayos de proliferación de linfocitos in vitro sugieren que las células T de la mayoría de estos voluntarios no reconocieron la repetición inmunodominante. Sin embargo, uno de los voluntarios vacunados en cada estudio no desarrolló parasitemia.

Los documentos WO 93/10152 y WO 98/05355 describen una vacuna derivada de la proteína de CS de P. falciparum y parece que ha habido algún progreso hacia la vacunación contra P. falciparum usando el planteamiento descrito en esta memoria descriptiva, véase también Heppner y col., 2005, Vaccine 23, 2243-50.

La proteína CS en P. falciparum tiene una región de repetición central que está conservada. Por el contrario se conocen al menos dos formas (designadas VK210 o tipo I y VK247 o tipo II) de la proteína CS para P. vivax. Esto hace más difícil identificar una construcción de la proteína de CS con todas las propiedades deseadas tales como inmunogenicidad, que proporciona protección general contra P. vivax independientemente del tipo específico de proteína CS debido a que los anticuerpos dirigidos a la región de repetición central de tipo I no reconocen necesariamente los epítopes en la región correspondiente de tipo II y viceversa.

Una proteína CS de P. vivax recombinante se expresó y se ensayó como una vacuna en los años 1980-1990 con un éxito limitado (Collins y col., 1989. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40, 455-64) . Se ha hecho algún trabajo para desarrollar una vacuna basada en Péptidos Antigénicos Múltiples (MAP) que emplean uno o más epítopes que están entrecruzados (Nardelli y Tam, 1995, Pharm. Biotechnol. 6, 803-19) . Los antígenos peptídicos de proteína CS de P. vivax que contienen las secuencias de región de repetición bien de la variante de tipo I o bien de la variante de tipo II conjugada con la región conservada (región II) que contiene la región de unión a hepatocitos prolongada para incluir un epítopo de células T, se han usado para inmunizar ratones (Thomas B.E. y cols., Annals of Tropical Medicine and Parasitology 2001, 95 (6) : 573-586) . Se vio una respuesta de proliferación de células T en células del bazo aisladas a partir de ratones inmunizados con estos conjugados.

La presente invención proporciona un nuevo antígeno, mejorado para uso en vacunas de malaria, que se cree que produce una respuesta humoral y también una respuesta inmune celular. El antígeno/partícula se cree que induce la producción de anticuerpos contra la proteína CS de tipo I y de tipo II. El antígeno/partícula también puede inducir células auxiliares T por ejemplo células Th1 y/o Th2.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona una proteína de fusión híbrida inmunógena que comprende:

a. al menos una unidad de repetición derivada... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de fusión híbrida inmunógena que comprende:

a. al menos una unidad de repetición derivada de la región de repetición de una proteína de circumsporozoito de tipo I de P. vivax,

b. al menos una unidad de repetición derivada de la región de repetición de una proteína de circumsporozoito de tipo II de P. vivax. y

c. antígeno S de superficie derivado del virus de Hepatitis B.

2. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la proteína comprende además un fragmento del extremo N-terminal que comprende el fragmento conocido como región (I) mostrado en la SEC ID N.º 1.

3. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que la proteína comprende además un fragmento del extremo C-terminal que comprende la sección conocida como región (II) mostrada en la SEC ID N.º 2.

4. Una proteína de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que la unidad de repetición de tipo I está seleccionada de uno o más monómeros mostrados en las SEC ID N.ºs 3 a 9.

5. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 4 que comprende al menos 9 unidades repetidas de tipo I.

6. Una proteína de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que la unidad de repetición de tipo II se selecciona entre uno o más monómeros mostrados en la SEC ID N.º 10 o la SEC ID N.º 14.

7. Una proteína de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende 1 repetición de tipo II.

8. Una proteína de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende además la inserción de 12 aminoácidos localizada en el final de la región de repetición encontrada en ciertas cepas asiáticas de P. vivax.

9. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 8, en la que los aminoácidos son los mostrados en la SEC ID N.º

11.

10. Una proteína de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el antígeno S de hepatitis B se deriva de un serotipo adw.

11. Una proteína de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende además uno o más antígenos adicionales derivados de P. falciparium y/o P. vivax.

12. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el antígeno se selecciona de DBP, PvTRAP, PvMSP2, PvMSP4, PvMSP5, PvMSP6, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, PvAMA1 y RBP.

13. Una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende la secuencia de proteína de circumsporozoito híbrida como se muestra en la SEC ID N.º 13.

14. Una composición que comprende una proteína de fusión híbrida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y un adyuvante.

15. Una composición de acuerdo con la reivindicación 14, en la que el adyuvante comprende QS21 .

3. MPL.

16. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15, en la que el adyuvante está formulado como liposomas.

17. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, que comprende además uno o más antígenos adicionales derivados de P. falciparum y P. vivax en mezcla.

18. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, que comprende un tensioactivo.

19. Una composición de acuerdo con la reivindicación 18, en la que el tensioactivo se selecciona de Tween, briji, polietilenglicol.

20. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en la que la composición es una vacuna.

21. Una partícula lipoproteica multimérica que comprende una proteína híbrida según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

22. Una composición que comprende una partícula como se define en la reivindicación 21 y al menos un excipiente/vehículo.

23. Una composición de acuerdo con la reivindicación 22, que comprende además un adyuvante.

24. Una composición de acuerdo con la reivindicación 23, en la que el adyuvante comprende QS21 .

3. MPL.

25. Una composición de acuerdo con la reivindicación 23 o 24, en la que el adyuvante se formula como liposomas.

26. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, que comprende además uno o más antígenos adicionales derivados de P. falciparium y/o P. vivax en mezcla.

27. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, que comprende además un tensioactivo.

28. Una proteína como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20 o una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27 para uso en tratamiento.

29. Uso de una proteína como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o de una partícula como se define en la reivindicación 21 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento/prevención de malaria.

30. Un uso de acuerdo con la reivindicación 29, en el que la malaria está provocada por P. vivax.

31. Una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

32. Un huésped que comprende una secuencia de nucleótidos como se define en la reivindicación 31.

33. Un procedimiento para la producción de una proteína como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1

a 13, dicho procedimiento comprende la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína en 20 un huésped adecuado y la recuperación del producto.

34. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 33, en el que el huésped es una levadura.

35. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 34, en el que el producto se recupera mediante lisis de las células huéspedes mediante tratamiento con una composición adecuada que comprende un tensioactivo.

FIG. 1. Microfotografía electrónica de las partículas de CSV-S producidas en la cepa Y1834

FIG. 2.

Minigel de tipo “Cambrex” al 4-20 %

15 1l de extracto clarificado/banda (+/- 50 1g de prot.)

Transferencia de 1: cepa huésped DC5 (control negativo)

2: Y1834 (CSV-S)

3: Y1631 (RTS, S)

1) Cepa huésped DC5 (control negativo)

2) Y1834 (CSV-S)

3) clon n.º 2 (CSV-S)

5 4) clon n.º 3 (CSV-S)

5) clon n.º 1 (CSVtr-S)

6) clon n.º 2 (CSVtr-S)

7) clon n.º 3 (CSVtr-S)

8) Y1631 (RTS/S)

10

FIG. 3.

Mapa de plásmido de pRIT15546

Plismido de 2 micr6metros pb)

Figura 5: mapa de plásmido de pRIT 15607

Figura 6: transferencia de Western de proteína recombinante expresada en la cepa Y1840

TW revelada con anticuerpo anti-S La cantidad total de proteína cargada está entre paréntesis.

1: GS115 (célula huésped de Pichia pastoris)

2: Y1840 (100 Ig)

3: Y1840 (50 Ig)

4: Y1840 (25 Ig)

5: Y1840 (12, 5 Ig)

6: Y1833 (100 Ig, cepa de S.c. que expresa CSV-S)

7: Y1835 (100 Ig, cepa de S.c. que coexpresa CSV-S y S)

MP

Figura 7: microfotografía electrónica de las partículas de CSV-S producidas en la cepa Y1840

Figura 8: mapa del plásmido de pRIT15582.

(13538 pb)

Figura 9: mapa de restricción del fragmento lineal XhoI usado para integrar el módulo CSV-S.

8500 pb Figura 10: transferencia de Western de las proteínas recombinantes expresadas en la cepa Y1835. Figura 11: microfotografía electrónica de las partículas mixtas de CSV–S, S producidas en la cepa Y1835

. (SEC ID N.º 21)