Vacuna contra la tuberculosis.

La presente invención se refiere a un microorganismo aislado perteneciente al género Mycobacterium caracterizado porque comprendela inactivación del gen Rv0757 que confiera un fenotipo PhoP- y la inactivación de un segundo gen que impide la producción de DIM(fenotipo DIM-).

Adicionalmente, la presente invención comprendeel uso de dicho microorganismo para la elaboración de una vacunapara la inmunización ó prevención de la tuberculosis.

Vacuna contra la tuberculosis La presente invención hace referencia a un microorganismo aislado perteneciente al género del complejo Mycobacterium tuberculosis, caracterizado porque comprende la inactivación del gen Rv0757 que confiere un fenotipo PhoP- y la inactivación del gen Rv2930 (fadD26) que impide la producción de DIM (fenotipo DIM-) . Adicionalmente, la presente invención comprende el uso de dicho microorganismo para la elaboración de una vacuna para la inmunización o prevención de la tuberculosis.

Antecedentes de la invención El uso de vacunas para prevenir la tuberculosis en humanos ha demostrado ser un formidable desafío durante cerca de un siglo. BCG, derivada de M. bovis, es hoy en día la única vacuna en uso contra la tuberculosis y es la vacuna más utilizada en todo el mundo. El desarrollo y administración generalizada de la vacuna BCG desde comienzos de los años 1920 representó un importante avance, con la expectativa de poder erradicar la tuberculosis del mundo. No obstante, las promesas iniciales no se lograron y, a partir de los resultados de un gran número de ensayos de eficacia, es evidente que la vacuna BCG, en su forma actual, es de un uso limitado para el control de la enfermedad, particularmente en las formas respiratorias en adultos de áreas del tercer mundo donde la enfermedad es endémica [4]. Con un mejor conocimiento de la virulencia del M. tuberculosis y los modelos de respuestas inmunes que conducen a la generación de inmunidad protectora, hace posible desarrollar vacunas mejores que la BCG. La observación de que los mayores niveles de protección se logran cuando el huésped se vacuna con BCG sugiere que la viabilidad y la persistencia son propiedades fundamentales que se requieren para el éxito de una vacuna contra la tuberculosis. En la presente invención, utilizamos una cepa de M. tuberculosis con el gen Rv0757 (phoP) inactivado y una segunda mutación independiente de phoP que impide la síntesis de DIM, como prototipo de vacuna viva de una sola dosis, y demostramos que, además de ser más atenuada que la BCG en los ratones inmunocomprometidos SCID, impartía niveles de protección comparables a los conferidos por BCG en ratones y una protección superior a BCG en cobayas.

El gen phoP junto con el phoR forma parte de un sistema de dos componentes que muestra un elevado grado de semejanza con otros sistemas de dos componentes que controlan la transcripción de genes clave de la virulencia en patógenos intracelulares. Controla además la expresión de otros muchos genes que no intervienen directamente en la virulencia [19]. La eliminación de los genes de la virulencia no parece ser, per se, el único método para la atenuación del M. tuberculosis. Se demostró que un mutante auxotrófico de pantotenato del M. tuberculosis, incapaz de una síntesis de novo del ácido pantoténico, persistía en ratones SCID, sin poder provocar la enfermedad [17]. Los auxótrofos de leucina individuales resultan también fuertemente atenuados e incapaces de replicación in vivo en ratones SCID [28]. Así pues, se admite en la actualidad generalmente el principio de que las cepas de vacunas basadas en el M. tuberculosis pueden ser atenuadas con éxito, mientras que se retienen los genes que se suprimen en la BCG de M. bovis.

En el pasado, la investigación de vacunas con eficacia superior a BCG se basaba en la noción de que la pérdida de virulencia de la BCG era en sí misma un factor que contribuía a su falta de eficacia protectora completa [32]. Se razonó, pues, que nuevos mutantes atenuados de M. tuberculosis, con menor virulencia, podrían resultar más efectivos como vacunas. No obstante, un reciente trabajo ha demostrado que la infección natural con M. tuberculosis y la vacunación con BCG no difieren en su capacidad para producir inmunidad protectora contra la tuberculosis [34]. Esto plantea las cuestiones de si es o no posible mejorar la BCG por atenuación racional de M. tuberculosis. Martin C. et al. Vaccine, April 2006, Vol. 24, No. 17, páginas 3408-3419 muestra que una cepa mutante de Mycobacterium tuberculosis que tiene el gen pop inactivado, se encuentra atenuada en comparación con la cepa parental, que se encuentra más atenuada que la cepa CGG y que proporciona niveles de protección comparables a aquellos conferidos por BGG en ratones y mayor protección que BGG en cobayas.

Infante E. et al., Clin. Exp. Immunol. 2005, Vol. 141, No. 1, páginas 21-28 muestra que un mutante de Mycobacterium tuberculosis que tenga el gen fadD26 inactivado y en consecuencia una alteración en la síntesis de DIM se encuentra atenuado, y que induce un mayor nivel de protección contra una cepa virulenta de M. tuberculosis que la cepa BGG. En este contexto, la observación de que la cepa mutante de M. tuberculosis de la presente invención con la combinación de 2 mutaciones independientes 1. en la síntesis de las proteína PhoP y 2. en la síntesis de DIM resulta más atenuada que BCG en el modelo de ratón SCID, incluso cuando se aplicaba a una dosis 10 veces superior a las de BGG, y el mayor grado de protección que BCG en el modelo de cobaya es particularmente sorprendente y relevante.

Breve descripción de la invención Un primer aspecto de la presente invención, hace referencia a un microorganismo aislado perteneciente al género complejo Mycobacterium tuberculosis, caracterizado porque comprende la inactivación del gen Rv 0757 (phoP) y una segunda mutación independiente de phoP que elimine la producción de DIM, que se encuentra en el gen Rv2930 (fadD26) , que consiste en la deleción del gen fadD26, que es esencial para la síntesis de DIM.

Un segundo aspecto de la presente invención hace referencia al uso del microorganismo aislado de la presente invención para la elaboración de una vacuna para la prevención de la tuberculosis en animales, y aún más preferentemente para la prevención de la tuberculosis en humanos, así como otros usos que actualmente tienen las vacunas contra la tuberculosis en el tratamiento de enfermedades en humanos como puede ser el cáncer de vejiga.

De aquí en adelante en el contexto de la presente invención la expresión “cepa SO2 de M. tuberculosis” se utilizará para hacer referencia al microorganismo aislado de la cepa de M. tuberculosis que se ha inactivado mediante el gen Rv0757 construida a partir de la cepa clínica de M. tuberculosis MT103 por la inserción de un marcador de resistencia a kanamicina en el sitio BclI del gen Rv0757 de M. tuberculosis, utilizando recombinación homóloga según el método descrito por Pelicic et al (1997) (Efficient allelic exchange and transposon mutagenesis in Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A 94: 10955-10960) , y que adicionalmente comprende la inactivación del gen fad D26 que elimine la producción de DIM (pthiocerol dimycocerosatos) . Por lo tanto, dicha cepa de la invención presenta dos mutaciones independientes en vacunas vivas atenuadas derivadas de M. tuberculosis no afectando la mutación independiente de phoP a las propiedades de la vacuna derivadas de la inactivación de dicho gen. En el ejemplo 9 se describe como construir un microorganismo aislado del género Mycobacterium con la doble mutación independiente que proporciona un fenotipo igual que la descrita para la cepa SO2 de M. tuberculosis.

De aquí en adelante en el contexto de la presente invención nos referiremos como vacuna a aquellos fármacos que al ser administrados producen defensas frente a la enfermedad que se quiere prevenir.

De aquí en adelante en el contexto de la presente invención nos referiremos como BCG a la actual vacuna en uso contra la tuberculosis desde 1921. Se trata de una vacuna viva atenuada derivada de una cepa de M. bovis que tras subcultivarse en el laboratorio perdió su virulencia y hoy sabemos que tiene más de cien de genes eliminados (5) .

De aquí en adelante en el contexto de la presente invención se utilizará H37Rv para hacer referencia a una cepa de M. tuberculosis patógena que ha sido secuenciada, en donde Cole, et al. hacen referencia a estos genes como Rv (Ref Cole et al 1998 Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 393: 537-544) .

De aquí en adelante en el contexto de la presente invención nos referiremos como MT103 a un aislamiento clínico de M. tuberculosis (Referencia 15 Camacho et al.)

De aquí en adelante en el contexto de la presente invención nos referiremos como cepa DIM- a aquella cepa del complejo M. tuberculosis que no es capaz de sintetizar phthiocerol dimycocerosatos, que son importantes lípidos relacionados con la patogenicidad de M. tuberculosis. En la figura 11 se utiliza la cepa 1A29 que consiste en la cepa MT103 que tiene inactivado el gen Rv2930 (fadD26) por el transposón... [Seguir leyendo]

1. Microorganismo aislado perteneciente al complejo Mycobacterium tuberculosis obtenido mediante la inactivación o la deleción de:

a) el gen phoP; y b) un segundo gen que evita la producción de DIM, en donde dicho gen es el gen fadD26.

2. Microorganismo aislado según la primera reivindicación, en donde el gen phoP está inactivado.

3. Procedimiento para construir el microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende

a) la inactivación o deleción del gen phoP; y

b) la inactivación o deleción de un segundo gen que evita la producción de DIM, en donde dicho gen es el gen fadD26.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación anterior, en donde el gen phoP está inactivado.

5. Vacuna para la inmunización contra o para la prevención de síntomas causados por la tuberculosis, que comprende un microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

6. Vacuna de acuerdo con la reivindicación anterior, que además comprende excipientes farmacéuticamente aceptables.

7. Proceso para la preparación de la vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 5-6 para inmunizar contra o prevenir los síntomas causados por la tuberculosis, que comprende al menos:

a) Incorporar un microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 a un medio adecuado para su administración en humanos o animales en una dosis terapéuticamente efectiva y

b) Opcionalmente adicionar excipientes farmacológicamente adecuados para la producción de vacunas.

8. Medicamento que comprende el microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

9. Medicamento que comprende el microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para su uso como vacuna.

10. Medicamento según la reivindicación 8 para su uso en el tratamiento del cáncer de vejiga.

11. Medicamento según la reivindicación 8 o 9 para su uso en el tratamiento o prevención de la tuberculosis.

12. Medicamento según la reivindicación 8 o 9 para su uso como vector o adyuvante.

13. Uso del microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para la elaboración de una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, para la prevención o inmunización frente a la tuberculosis en humanos o animales.