Vacuna contra el intermediario de plegado amiloide.

Péptido cíclico que consiste en la fórmula X2X3VGSNK-Z o X3VGSNKG-Z,

donde X2 es E, G, Q o K, X3 es D o N y Zes un agente estabilizante del plegado presente en la secuencia peptídica X2X3VGSNK o X3VGSNKG, donde el péptidoestá ciclado por enlace covalente del aminoácido N-terminal de la secuencia peptídica para Z, y donde Z es unfragmento peptídico seleccionado del grupo que consiste en YNGK, TCGV, CGNT, LCGT, LKGT, GAIK, GAIC, AIIK,AIIC, TCGV, CGNT, LCGT y LKGT, donde c ≥ D-Cys y donde k ≥ D-Lys; o donde Z es un esqueleto de esteroide, quees un ácido biliar o un derivado del mismo.

Vacuna contra el intermediario de plegado amiloide Campo de la invención [0001] La invención se refiere a una vacuna mejorada que se puede usar para tratar la enfermedad de Alzheimer.

Antecedentes de la invención [0002] La Organización Mundial de la Salud estima que 18 millones de personas padecen la enfermedad de Alzheimer a nivel mundial (Vas et al. 2001) . En los Países Bajos, aproximadamente 250 000 personas tienen la enfermedad de Alzheimer. El problema está creciendo con el aumento de la edad media de la población. Cuidar a un paciente en un asilo de ancianos se estima que cuesta 30 000-60 000? por año (McDonnell et al. 2001) . La vacunación sería rentable.

La enfermedad de Alzheimer es un trastorno conformacional neurodegenerativo (Sadowski & Wisniewski 2004, Blennow et al. 2006, Editorials Nature Med. 2006) . Una característica de la enfermedad es la formación de placas en el cerebro o en los vasos sanguíneos del cerebro. Estas placas se originan de una proteína unida a la membrana neuronal, la proteína amiloide precursora. Un fragmento a-helicoidal de 38-43 (típicamente 42) residuos de aminoácidos se divide enzimáticamente de la proteína formando así un péptido llamado soluble Aº. º probablemente primero adopta una conformación extendida y está presente en todos los líquidos biológicos. Si es soluble, Aº alcanza una alta concentración, sufrirá cambios conformacionales y agregados de forma. Una plétora de agregados ha sido encontrada in vitro o in vivo, incluyendo múltiples confórmeros de monómero, diferentes tipos de oligómeros, ligandos difundibles Aº-derivados, protofibrillas, fibrillas y esferoides (adoptados de Klein et al. 2004) . Aº fibrilar tiene una estructura de espina beta cruzada (Sawaia et al. 2007) y es finalmente depositada en el cerebro para formar las placas neurodegenerativas.

La inmunización de ratones transgénicos (Schenk et al. 1999) y pacientes humanos en una prueba clínica de fase I (Hock et al. 2002) con una suspensión de "pre-agregado" Aº1-42 parece ser beneficiosa. Los anticuerpos en sueros inmunológicos humanos reconocieron placas, depósitos de Aº y º-amiloide en los vasos sanguíneos del cerebro. Los anticuerpos no reconocieron la proteína amiloide precursora o soluble Aº.

Una desventaja de la suspensión de "pre-agregado" Aº1-42 es que las propiedades físicas de este material están mal definidas. No obstante, un problema mucho más serio fue la inducción de meningoencefalitis como un efecto secundario relacionado con la vacuna en el 6% de los pacientes durante un ensayo clínico en fase II (Check 2002, Gilman et al. 2005) . Este efecto secundario se produce por una reacción inflamatoria celular, atribuida a una respuesta celular Th1 a epítopos localizados en la parte C-terminal y central de Aº11- 42 (McLaurin et al. 2002, Gelinas et al. 2004) .

Se ha demostrado que los anticuerpos beneficiosos inducidos por Aº1-42 se dirigen contra el N-término (McLaurin et al. 2002, (Lee et al. 2005) . Fue, por lo tanto, propuesto usar péptidos Aº C-terminalmente truncados como inmunógenos (Sigurdsson et al. 2004, Lemere et al. 2006, Gevorkian et al. 2004, Lemere et al. 2007) . Tales péptidos cortos son poco inmunogénicos. Para aumentar la inmunogenicidad, copias múltiples del péptido deberían ser acopladas a portadores no-inmunogénicos (con el objetivo de introducir IgM) o a portadores que proporcionen epítopos de células t heterólogos (Agadjanyan et al. 2005, Ghochikyan et al. 2006, Maier et al. 2006, (Movsesyan et al. 2008) ) . En ninguno de estos conjugados el péptido está previsto que adopte la conformación de residuos 4-10 como expuesto por los oligómeros de º amiloide o pre-fibrillas. Así, los anticuerpos inducidos con conjugados de péptido truncados se espera que sean débilmente específicos para los oligómeros o pre-fibrillas.

Por lo tanto, hay todavía una necesidad de un medicamento eficaz, preferiblemente una vacuna contra la enfermedad de Alzheimer. La presente invención proporciona una vacuna mejorada, que no tiene todos los inconvenientes de las vacunas existentes: menos que ninguna toxicidad y todavía es capaz de inducir una respuesta de anticuerpo eficaz para inmunización. La vacuna propuesta en la presente invención es un nuevo análogo del péptido ºamiloide.

WO-A-02055552 (Fraunhofer Ges. et al.) divulga péptidos cíclicos derivados de proteína de amiloide que se usan para un alcance pertinente. No obstante, estos péptidos son más bien largos y muestran por lo tanto una toxicidad notable.

Descripción de la invención Péptidos de la invención [0009] En un primer aspecto de la invención, se proporciona un péptido comprendiente la siguiente secuencia X2X3VGSNK- Z o X3VGSNKG-Z, donde tal y como se define en la reivindicación 1 X2 es E, G, Q o K, X3 es D o N, y Z es un agente que estabiliza el presente pliegue dentro de la secuencia peptídica X2X3VGSNK-Z o X3VGSNKG-Z. Los péptidos de la invención son péptidos modificados que deben ser entendidos aquí como péptidos que no son un A 1-42 de origen natural. Z puede también ser definido como un agente que estabiliza la conformación de X2X3VGSNK (identidad SEC nº 2) o X3VGSNKG (identidad SEC nº 3) como posiblemente adoptado en A 1- 42, preferiblemente como adoptado en A 1-42. Las secuencias peptídicas X2X3VGSNK y X3VGSNKG como identificadas arriba corresponden respectivamente a aminoácidos 22-28 y 23-29 de A 1-42. Una secuencia de péptido preferida es X2X3VGSNK que corresponde a aminoácidos 22-28 de A 1-42. Las posibles identidades diferentes para X1, X2 y X3 como se indica aquí vienen de la presencia de varias mutaciones conocidas en la población humana en la secuencia de A 1-42: X2 es aminoácido 22 y es predominantemente E en la población. No obstante, las mutaciones ártica (E22G) , holandesa (E22Q) e italiana (E22K) son también conocidas. Recientemente, otra mutación ha sido identificada (E22f) (Tomiyama et al. 2008) . X3 es el aminoácido 23 y es predominantemente D. No obstante, la mutación de Iowa ya ha sido identificada (D23N) . Por lo tanto, es obvio para la persona experta que si cualquier otra mutación fuera identificada más adelante en una parte específica de A 1-42 como se identifica aquí; es decir el aminoácido 21-27, 22-28 o 23-29, la secuencia del péptido de la invención puede posiblemente ser adaptada para tener en cuenta esta mutación identificada más adelante.

Diferentes secuencias peptídicas de superposición fueron evaluadas (ver el ejemplo) . Hasta donde nosotros somos conscientes, dos de las secuencias peptídicas evaluadas (aa 22-28 o 23-29) fueron capaces de inducir una respuesta de anticuerpo en ratones, este anticuerpo fue específicamente capaz de reconocer un epítopo conformacional de A 1-42 como expresado en el monómero, oligómero soluble (Haass and Selkoe 2007, Lambert et al, 2007, and Wash and Selkoe, 2007) , fibrillas o placas neurodegenerativas. Parece que el reconocimiento del Ab oligomérico es incluso más crucial que el reconocimiento de fibrilla o placa, ya que el Ab oligomérico es más tóxico para las neuronas. El aclaramiento de oligómeros solubles mejora rápidamente la cognición mientras que las placas están todavía presentes. La funcionalidad de un péptido de la invención es preferiblemente evaluada tal y como se expone en el ejemplo 2: ELISA. El uso de conjugados de péptido-BSA como antígenos de recubrimiento en el ELISA permite determinar del título de anti-péptido, mientras que el recubrimiento de A 1-42 fibrilar y oligomérico permite la detección de reactividad cruzada específica. El experto en la materia entenderá que cualquier otra secuencia peptídica derivada de A 1-42 e incorporada en un péptido según la invención y que sea capaz de adoptar la conformación de X2 X3 VGSNK o X3 VGSNKG como posiblemente adoptada en Aº 1-42 es también abarcada por la presente invención.

En una forma de realización, el péptido de la invención consiste en la fórmula X2X3VGSNK-Z o X3VGSNKG-Z, donde X2 es E, G, Q o K, X3 es D o N, y Z es un agente que estabiliza el plegado presente en la secuencia peptídica X1X2X3VGSN, X2X3VGSNK o X3VGSNKG como se define en la reivindicación 1.

En un péptido de la invención, es crítico que el plegado presente dentro de X2X3VGSNK o X1X2X VGSN sea estabilizado ya que nuestro objetivo es diseñar un péptido que imite un epítopo conformacional presente en el A 1-42 plegado, tal y como se expresa en el monómero, oligómero soluble, fibrillas o placas neurodegenerativas. Cualquier modo de realización de esta estabilización es abarcada por la presente invención. El experto en la materia después de tener sintetizado tal péptido de la invención puede probar su conformación por un método conocido en la técnica, por... [Seguir leyendo]

1. Péptido cíclico que consiste en la fórmula X2X3VGSNK-Z o X3VGSNKG-Z, donde X2 es E, G, Q o K, X3 es D o N y Z es un agente estabilizante del plegado presente en la secuencia peptídica X2X3VGSNK o X3VGSNKG, donde el péptido está ciclado por enlace covalente del aminoácido N-terminal de la secuencia peptídica para Z, y donde Z es un fragmento peptídico seleccionado del grupo que consiste en YNGK, TCGV, CGNT, LCGT, LKGT, GAIK, GAIC, AIIK, AIIC, TCGV, CGNT, LCGT y LKGT, donde c = D-Cys y donde k = D-Lys; o donde Z es un esqueleto de esteroide, que es un ácido biliar o un derivado del mismo.

2. Péptido según la reivindicación 1, donde el ácido biliar o derivado del mismo es seleccionado del grupo que consiste en ácido cólico, ácido desoxicólico y metil 7-a-acetoxi-3a-amino-12a-amino-5 -colan-24-oato.

3. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el péptido se conjuga a una molécula portadora inmunogénica. 15

4. Péptido según la reivindicación 3, donde el péptido se conjuga a la molécula portadora inmunogénica por un enlace covalente selectivo de Z a la molécula portadora inmunogénica.

5. Péptido según la reivindicación 3 o 4, donde la molécula portadora inmunogénica es toxoide tetánico. 20

6. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, para su utilización como medicamento.

7. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, para su utilización en el tratamiento o prevención de la

enfermedad de Alzheimer. 25

8. Uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la enfermedad de Alzheimer.

9. Método para producir un péptido cíclico como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, donde el método 30 incluye las siguientes etapas de:

a) sintetizar un péptido cíclico que consiste de la secuencia X2X3VGSNK-Z o X3VGSNKG-Z, donde X2 es E, G, Q o K, X3 es D o N, donde el péptido es ciclado por enlace covalente del aminoácido N-terminal de la secuencia peptídica para Z, y donde Z es un agente estabilizante del plegado presente en la secuencia peptídica X2X3VGSNK o X3VGSNKG, tal y como se define en la reivindicación 1 o 2 y

b) opcionalmente, conjugar una molécula portadora inmunogénica al péptido cíclico obtenido en a) , preferiblemente a través de un enlace de Z a la molécula portadora inmunogénica.

10. Anticuerpo dirigido contra el péptido tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5.

11. Método in vitro para diagnosticar una enfermedad o condición neurodegenerativa, donde el método comprende el paso de determinar en una muestra de un paciente la presencia o ausencia de una placa beta-amiloide, usando un anticuerpo tal y como se ha definido en la reivindicación 10.

12. Método in vitro según la reivindicación 11, para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer.