Utilización de la proteína IRAP para la realización de métodos de diagnóstico y de pronóstico.

Utilización del dominio extracelular circulante de la proteína IRAP ("insulin responsive aminopeptidase"),

para la realización de un método de dosificación in vitro de la concentración en dominio extracelular segregado de la proteína IRAP en el suero o el plasma de un mamífero, en particular del ser humano, siendo dicha dosificación efectuada con la ayuda de un anticuerpo monoclonal dirigido contra la parte extracelular de la proteína IRAP representada por las SEC ID no 7 a 11.

Utilización de la proteína IRAP para la realización de métodos de diagnóstico y de pronóstico.

La invención se refiere a la utilización de la proteína IRAP para la realización de métodos de diagnóstico y de pronóstico.

La proteína IRAP (Insulin-Regulated AminoPeptidase; EC 3.4.11.3) también conocida bajo el nombre de Leucina Amino Peptidasa Placentaria (P-LAP) y de Leucina-cistinil aminopeptidasa (L-CAP) es una proteína metaloproteinasa de zinc transmembranaria que existe en tres isoformas (Swiss-Prot: Q9UIQ6: 1, 2 y 3; representadas respectivamente por las SEC ID no 1 a 3) .

Cuando está insertada a nivel de la membrana plasmática, su dominio extracelular puede ser escindido y segregado.

La parte segregada de una isoforma no especificada de la proteína presunta de ser IRAP se analizó en la sangre mediante un método enzimático utilizando un sustrato sintético no específico, la L-leucina-nitroanilida en presencia de metionina (Mizutani, S., Yoshino, M., y Oya, M. (1976) Clin Biochem 9 (1) , 16-18) .

Utilizando este método, Mizutani, Oya y Tomoda han puesto en evidencia una cistinil-leucina aminopeptidasa en el suero de las mujeres embarazadas, cuya concentración aumenta durante el embarazo (Yamahara, N., Nomura, S., Suzuki, T., Itakura, A., Ito, M., Okamoto, T., Tsujimoto, M., Nakazato, H., y Mizutani, S: (2000) Life Sci 66 (15) , 14011410) . Esta aminopeptidasa es esencialmente de origen placentario, razón por la cual se ha denominado P-LAP (Tsujimoto, M., Mizutani, S., Adachi, H., Kimura, M., Nakazato, H., y Tomoda, Y. (1992) Arch Biochem Biophys 292 (2) , 388-392) y corresponde al dominio segregado de la proteína.

Esta enzima degrada la oxitocina (Naruki, M., Mizutani, S., Goto, K., Tsujimoto, M., Nakazato, H., Itakura, A., Mizuno, K., Kurauchi, O.; Kikkawa, F., y Tomoda, Y. (1996) Peptides 17 (2) , 257-261) , la vasopresina (Wallis, M. G., Lankford,

M. F., y Keller, S. R. (2007) Am J Physiol Endocrinol Metab 293 (4) , E1092-1102) , la angiotensina II y III (Matsumoto, H., Rogi, T., Yamashiro, K., Kodama, S., Tsuruoka, N., Hattori, A., Takio, K., Mizutani, S., y Tsujimoto, M: (2000) Eur J Biochem 267 (1) , 46-52) así como una serie de otros péptidos (Albiston, A. L., Peck, G. R., Yeatman, H. R., Fernando, R., Ye, S., y Chai, S. Y. (2007) Pharmacol Ther 116 (3) , 417-427) . Las concentraciones séricas de esta aminopeptidasa no se han citado nunca en el hombre ni el la mujer no gestante.

En el momento de su clonación, apareció que P-LAP corresponde a la proteína IRAP así como al receptor e la angiotensina IV (Keller, S. R., Scott, H. M., Mastick, C. C., Aebersold, R., y Lienhard, G. E. (1995) J Biol Chem 270 (40) , 23612-23618; Rogi, T., Tsujimoto, M., Nakazato, H., Mizutani, S., y Tomoda, Y. (1996) J Biol Chem 271 (1) , 56-61; Albiston, A. L., McDowall, S. G., Matsacos, D., Sim, P., Clune, E., Mustafa, T., Lee, J., Mendelsohn, F. A., Simpson, R. J., Connolly, L. M., y Chai, S. Y. (2001) J Biol Chem 276 (52) , 48623-48626) .

La solicitud de patente WO 2005/038462 describe un reactivo para el diagnóstico y/o una evaluación pronóstica de carcinomas que comprende un anticuerpo policlonal anti-P-LAP, obtenido por inmunización con la proteína P-LAP entera. Debido a la fuerte homología entre las diferentes aminopeptidasas, el anticuerpo no es aparentemente específico para IRAP y debería también reconocer otras aminopeptidasas. Por lo tanto, no debería permitir diagnosticar una patología relacionada de manera precisa a una modificación de la expresión o de la concentración plasmática de IRAP.

GLUT4 es el transportador de glucosa que permite la captación de la glucosa que circula por los músculos y el tejido adiposo en respuesta a la insulina. En unas condiciones no estimuladas (condiciones basales) , GLUT4 está eficazmente retenido en el interior de la célula en unos compartimientos (vesículas) intracelulares, por un mecanismo de retención aún desconocido. En respuesta a la estimulación insulínica, GLUT4 es transportado y después insertado en la membrana plásmica por una translocación incrementada, permitiendo así la captación celular de glucosa.

La IRAP se co-localiza con el transportador de glucosa GLUT4 y es co-translocada con este de manera estequiométrica (Keller, S. R (2004) Biol Pharm Bull 27 (6) , 761-764) . Esta translocación hacia la membrana plásmica es estimulada por la insulina de la misma manera que la de GLUT4 (Kar y lowski, O., Zeigerer, A., Cohen, A., y McGraw, T. E. (2004) Mol Biol Cell 15 (2) , 870-882; Subtil, A., Lampson, M. A., Keller, S. R., y McGraw, T. E. (2000) J Biol Chem 275 (7) , 4787-4795) .

Por otra parte, la expresión de IRAP condiciona la expresión de GLUT4 ya que en los animales transgénicos IRAP-l-, los porcentajes de GLUT4 son reducidos del 50 al 80% (Keller, S. R., Davis, A. C., y Clairmont, K. B. (2002) J Biol Chem 277 (20) , 17677-17686) .

En el diabético de tipo 2 se encuentra al mismo tiempo una reducción de la expresión y de la translocación de GLUT4 hacia la membrana plásmica en el músculo y el tejido adiposo (Kahn, B. B. (1992) J Clin Invest 89 (5) , 13671374) .

Asimismo, y aunque los porcentajes celulares de IRAP no sean modificados, su translocación es igualmente disminuida en el músculo y el tejido adiposo de los diabéticos de tipo 2 (Garvey, W. T., Maianu, L., Zhu, J. H., Brechtel-Hook, G., Wallace, P., y Baron, A. D. (1998) J Clin Invest 101 (11) , 2377-2386; Maianu, L., Keller, S. R., y Garvey, W. T. (2001) J Clin Endocrinol Metab 86 (11) , 5450-5456) .

Por otra parte, se ha mostrado una relación entre la proteína IRAP y el desarrollo de la quimiorresistencia a los medicamentos anticancerosos (Kondo C. et al., Int J. Cancer, 118, 1390-1394, 2006) . Según este artículo, la IRAP reduce en efecto la sensibilidad a los medicamentos anticancerosos inhibiendo la expresión del factor de activación de la apóptosis y el aumento de la expresión del factor de inhibición de la apóptosis.

El dominio extracelular de la IRAP está escindido por unas metaloproteasas que pertenecen aparentemente a la familia de las ADAM, de la cual ADAM9 (SwissProt Q13443) y ADAM12 (SwissProt 043184) (Ito, N., Nomura, S., Iwase, A., Ito, T., Kikkawa, F., Tsujimoto, M., Ishiura, S., y Mizutani, S. (2004) Biochem Biophys Res Commun 314 (4) , 1008-1013) y liberado en la circulación sanguínea. ADAM9 (MDC9) está expresada en diferentes tejidos, entre ellos el músculo esquelético y el tejido adiposo (Hotoda, N., Koike, H., Sasagawa, N., y Ishiura, S. (2002) Biochem Biophys Res Commun 293 (2) , 800-805) y ADAM12 está esencialmente expresada en el músculo. Otros miembros diferentes de esta familia están igualmente expresados en el músculo y el tejido adiposo.

Hoy día, las únicas relaciones descritas entre la concentración del dominio extracelular de la IRAP en un medio biológico y una patología que se refiere a la preeclampsia severa, así como a la amenaza de parto prematuro. En estas dos patologías, las concentraciones de P-LAP circulante son inferiores a las observadas en las mujeres control de edad gestacional equivalente. Sin embargo, los métodos descritos en la técnica anterior están basados en el ensayo enzimático, por medio de un sustrato no específico del dominio extracelular de la IRAP.

Así, existe una necesidad real de proporcionar un método fiable y específico que permita ensayar el dominio extracelular de la IRAP circulante.

Uno de los objetivos de la presente invención es proporcionar un método de dosificación in vitro de la concentración en proteína IRAP en el suero o el plasma o los tejidos de un mamífero, específicamente del dominio extracelular de la proteína IRAP.

Otro objetivo de la invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal específico del dominio extracelular de las diferentes isoformas de la proteína IRAP.

Otro objetivo de la invención es proporcionar un método de diagnóstico de patologías en las que están implicado un exceso o una disminución de la concentración en la proteína IRAP.

Un último objetivo es proporcionar un anticuerpo monoclonal específico del dominio extracelular de las diferentes isoformas de la proteína IRAP e inhibidor de su actividad enzimática en una óptica terapéutica.

Por consiguiente, la presente invención está ilustrada por la utilización del dominio extracelular de la proteína IRAP ("insulin-responsive aminopeptidase") , para la realización de un método de dosificación in vitro de la concentración en dominio extracelular segregado de la proteína IRAP en el suero, el plasma o los tejidos de un mamífero, en particular del ser humano.

La invención se refiere a la utilización del dominio extracelular circulante de... [Seguir leyendo]

1. Utilización del dominio extracelular circulante de la proteína IRAP ("insulin responsive aminopeptidase") , para la realización de un método de dosificación in vitro de la concentración en dominio extracelular segregado de la proteína IRAP en el suero o el plasma de un mamífero, en particular del ser humano, siendo dicha dosificación efectuada con la ayuda de un anticuerpo monoclonal dirigido contra la parte extracelular de la proteína IRAP representada por las SEC ID no 7 a 11.

2. Utilización del dominio extracelular circulante de la proteína IRAP según la reivindicación 1, para el diagnóstico y/o el pronóstico in vitro, o el seguimiento in vitro de patologías relacionadas con defectos de translocación del transportador de glucosa GLUT4 o de proteínas asociadas.

3. Utilización del dominio extracelular circulante de la proteína IRAP según la reivindicación 2, para el diagnóstico y/o el pronóstico in vitro de patologías asociadas a la sobreexpresión y/o al aumento de la translocación hacia la membrana de la IRAP y/o de sus isoformas y/o variantes con respecto a un individuo sano, o el seguimiento in vitro de patologías asociadas a la sobreexpresión y/o al aumento de la translocación hacia la membrana de la IRAP y/o de sus isoformas y/o variantes en un paciente, con respecto a un individuo sano.

4. Utilización del dominio extracelular circulante de la proteína IRAP según la reivindicación 2, para el diagnóstico y/o el pronóstico in vitro de patologías asociadas a la subexpresión y/o a la disminución de la translocación hacia la membrana de IRAP y/o de sus isoformas y/o variantes con respecto a un individuo sano, o el seguimiento in vitro de patologías asociadas a la subexpresión y/o a la disminución de la translocación hacia la membrana de la IRAP o de sus isoformas o variantes en un paciente.

5. Utilización del dominio extracelular circulante de la proteína IRAP según la reivindicación 2, para el diagnóstico y/o el pronóstico in vitro de la quimiorresistencia a los medicamentos anticancerosos.

6. Utilización del dominio extracelular circulante de la proteína IRAP según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 o 4, en la que las patologías están entre las asociadas a la insulino-resistencia, la diabetes de tipo 2, la diabetes gestacional, la hipertensión gestacional, la hipertensión gravídica (preclamsia) y la amenaza de parto prematuro.

7. Utilización del dominio extracelular circulante de la proteína IRAP y/o de sus isoformas y/o variantes según la reivindicación 1 o 2, en la que las patologías son unas enfermedades proliferativas y en particular los cánceres, en particular aquéllos en los que están sobreexpresadas la IRAP y/o sus isoformas y/o variantes y/o cuya translocación hacia la membrana está aumentada, tales como el adenocarcinoma ovárico, el cáncer de endometrio, el coriocarcinoma, el cáncer de páncreas, el cáncer de mama, el cáncer de próstata, el cáncer de estómago, el cáncer de recto o los cánceres de la esfera ORL, las enfermedades autoinmunes o inflamatorias.

8. Anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente el dominio extracelular circulante, o uno de sus epítopos del dominio extracelular, de la proteína IRAP (insulin responsive aminopeptidase) , estando dicho dominio extracelular definido por las secuencias SEC ID no 7 a 11.

9. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 8, siendo dicho anticuerpo monoclonal elegido de entre:

- el anticuerpo monoclonal segregado por el hibridoma depositado en la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, Francia) , el 2 de julio de 2009, bajo el número de registro CNCM I-4181,

- el anticuerpo monoclonal segregado por el hidridoma depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009, bajo el número de registro CNCM I-4182,

- el anticuerpo monoclonal segregado por el hidridoma depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009, bajo el número de registro CNCM I-4183,

- el anticuerpo monoclonal segregado por el hidridoma depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009, bajo el número de registro CNCM I-4184, y

- el anticuerpo monoclonal segregado por el hidridoma depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009, bajo el número de registro CNCM I-4185.

10. Anticuerpo según la reivindicación 8 o 9, estando dicho anticuerpo marcado con un compuesto seleccionado de entre un radionucleido, un fluoróforo, un punto cuántico, un marcador de enzima, un sustrato de enzima, un co-factor de enzima, un inhibidor de enzima o un hapteno.

11. Anticuerpo según la reivindicación 8 o 9, siendo dicho anticuerpo un anticuerpo humanizado.

12. Anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, para una utilización como medicamento, en particular para el tratamiento de los cánceres, en particular aquéllos en los que están sobreexpresadas la IRAP y/o sus isoformas y/o variantes, y/o cuya translocación hacia la membrana está aumentada, tales como el adenocarcinoma ovárico, el cáncer de endometrio, el coriocarcinoma, el cáncer de páncreas, el cáncer de mama, el cáncer de próstata, el cáncer de estómago, el cáncer de recto o los cánceres de la esfera ORL, las enfermedades autoinmunes o inflamatorias, o para el tratamiento de la resistencia a la quimioterapia.

13. Hibridoma que produce un anticuerpo según la reivindicación 8 o 9, en particular un hibridoma seleccionado de entre:

a. el hibridoma depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009, bajo el número de registro CNCM I-4181,

b. el hibridoma depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009, bajo el número de registro CNCM I-4182,

c. el hibridoma depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009, bajo el número de registro CNCM I-4183,

d. el hibridoma depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009, bajo el número de registro CNCM I-4184, y

e. el hibridoma depositado en la CNCM el 2 de julio de 2009, bajo el número de registro CNCM I-4185.

14. Procedimiento de dosificación in vitro de la concentración en proteína IRAP en un mamífero, que comprende una etapa de determinación de la concentración del dominio extracelular circulante de la proteína IRAP, en suero o plasma de un mamífero, en el que la dosificación se efectúa o bien mediante un método inmunoenzimático, o bien mediante un método inmunohistoquímico, o bien por RIA o IRMA.

15. Método de diagnóstico in vitro de patologías asociadas a la insulino-resistencia, la diabetes de tipo 2, la diabetes gestacional, la hipertensión gravídica (preeclampsia) , la amenaza de parto prematuro, y que comprende las etapas siguientes:

a. la determinación in vitro de la concentración de dominio extracelular circulante de la proteína IRAP, y/o de una de sus isoformas, en un mamífero con la ayuda de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11,

b. la comparación de dicha concentración obtenida en la etapa a. con la obtenida in vitro en un mamífero sano,

c. la deducción a partir de la etapa b. anterior, del hecho de que el mamífero presenta una insulino-resistencia, si la concentración obtenida en la etapa a. es inferior a la de la etapa b.

16. Método de diagnóstico in vitro de patologías asociadas a los cánceres, en particular aquéllos en los que está sobreexpresada la IRAP y/o una de sus isoformas, y/o cuya translocación hacia la membrana está incrementada, tales como el adenocarcinoma ovárico, o a enfermedades autoinmunes o inflamatorias, o a la resistencia a la quimioterapia, y que comprenden las etapas siguientes:

a. la determinación in vitro de la concentración de dominio extracelular circulante de la proteína IRAP, y/o de una de sus isoformas, y/o variantes en un mamífero, con la ayuda de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11,

b. la comparación de dicha concentración obtenida en la etapa a. con la obtenida in vitro en un mamífero control,

c. la deducción a partir de la etapa b. anterior, del hecho de que el mamífero presenta un cáncer, si la concentración obtenida en la etapa a. es superior a la de la etapa b.

17. Kit para la determinación in vitro de la concentración de dominio extracelular circulante de la proteína IRAP, y/o de una de sus isoformas en un mamífero, que comprende por lo menos un tampón, y por lo menos un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.

18. Kit según la reivindicación 17, que comprende asimismo un sustrato de la proteína IRAP así como un péptido reconocido por el anticuerpo.