UTILIZACIÓN DEL PÉPTIDO SINTÉTICO DERIVADO DE LA PROTEÍNA ZEBRA PARA EL DIAGNÓSTICO IN VIVO DE LA REACTIVACIÓN DEL VIRUS DE EPSTEIN-BARR (EBV).

Utilización del péptido sintético derivado de la proteína Zebra para el diagnóstico in vivo de la reactivación del virus de Epstein-Barr (EBV). La presente invención se refiere a la utilización de un péptido sintético derivado de la proteína ZEBRA, para el diagnóstico in vitro de la reactivación del virus de Epstein-Barr (EBV). La presente invención se refiere particularmente a un procedimiento para la determinación del nivel de los anticuerpos IgG para diagnosticar la reactivación del EBV. El virus de Epstein-Barr (EBV) es un virus herpes-gamma que establece una infección latente en los linfocitos B humanos, que transforma de forma eficiente las células en progenies celulares linfoblastoides (LCL), y que está implicado en la etiología de la mononucleosis infecciosa, linfoma de Burkitt (BL), enfermedad de Hodgkin, carcinoma nasofaríngeo (NPC) y las enfermedades linfoproliferativas en individuos inmunocomprometidos (Epstein MA & Crawford DH, 2005; Klein G, 2005; Cohen Jl, 2005). Mientras que la infección primaria es acompañada a menudo por un período autolimitado de enfermedad clínica, la latencia prolongada no presenta síntomas. Después de la activación, la transcripción de los genes virales cambia desde la fase latente a la fase lítica, que conduce a la potenciación de la replicación y a la producción vírica. El virus puede adoptar cuatro programas de latencia (latencia 0, l, ll y lll). En los individuos sanos, la infección EBV latente parece estar limitada a las células B de memoria en reposo, (Babcock et al, 1998). Los únicos productos génicos del EBV que se detectan de forma consistente en estas células son (i) las proteínas de membrana LMP1 y LMP2A/2B latentes (ii), los EBNA (Antígenos Nucleares del Epstein-Barr), que definen un patrón de expresión génica en la latencia denominada actual (Thorley-Lawson et al, 1996). En las biopsias del linfoma de Burkitt, sólo se expresa (latencia 1) el antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBNA1). En la enfermedad de Hodgkin, NPC y en los linfomas de las células T, se expresan (latencia ll) EBNA 1 y combinaciones variables de los tres miembros de la familia de las proteínas de membrana latentes (LMP1, LMP2 y LMP2B). Durante la mononucleosis infecciosa aguda, en los síndromes linfoproliferativos en los individuos inmunocomprometidos, y en LCL establecidos in vitro, se expresan (latencia III) la totalidad de los seis antígenos nucleares (EBNA 1-6). Además, se expresan los tres LMP. Las progenies celulares infectadas por EBV son, bien completamente no productivas de partículas virales, o contienen además una pequeña subpoblación de células que han cambiado espontáneamente de un estado infeccioso latente a un ciclo lítico. El mecanismo del cambio no se conoce completamente, pero uno de las primeras alteraciones detectables en la expresión génica viral es la activación del gen inmediato-prematuro BZLF1 de EBV, que codifica el transactivador ZEBRA de cambio lítico (Flemington et al, 1991). ZEBRA, junto con el producto proteico del gen BRLF1, inicia entonces la cascada del ciclo lítico (Feederle et al, 2000). Los adultos EBV-positivos, inmunológicamente sanos o inmunodeprimidos, presentan un nivel de replicación lítica idéntico del virus EBV (Hong et al, 2005, Montone et al, 1996). Esta replicación activa del virus es probablemente necesaria para la persistencia a lo largo de la vida. Mientras que los individuos inmunocompetentes pueden limitar la proliferación de las células infectadas por el virus EBV y muestran a menudo perfiles séricos estandarizados, los que muestran inmunodeficiencia congénita o adquirida son muy susceptibles a las linfoproliferaciones asociadas al EBV. La proteína ZEBRA (SEC ID nº 6) es un factor de transcripción y contiene tres dominios funcionales que están formados por la parte amino terminal de un dominio transactivador, un dominio de unión al ADN y la parte carboxiterminal de la proteína, un dominio de dimerización. ZEBRA es una proteína muy inmunogénica y contiene muchos epítopos que pueden ser reconocidos por los anticuerpos. Algunos estudios dan a conocer la utilización de la proteína ZEBRA para detectar la reactivación del EBV: Drouet et al (Drouet et al, 1999), dan a conocer la utilización de la proteína ZEBRA para la detección de la enfermedad de Hodgkin. ZEBRA permite detectar en el suero de los pacientes anticuerpos dirigidos contra ZEBRA, de forma dependiente de la dosis. Touge et al (Touge et al, 2006) y Tedeschi et al (2006), dan a conocer la utilización de ZEBRA para detectar la reactivación de EBV en pacientes con uveítis o leucemia, respectivamente. Dardari et al (Dardari et al, 2001), dan a conocer la utilización de ZEBRA y de las proteínas p54 y p138 para potenciar la reactivación de EBV. 2   Aunque todos los documentos previos dan a conocer procedimientos que utilizan la proteína ZEBRA para detectar la reactivación de EBV, ninguno de estos documentos menciona que los fragmentos de ZEBRA pueden utilizarse para proporcionar un procedimiento que detecte la reactivación de EBV. Entre los epítopos de ZEBRA, se han identificado dos polipéptidos principales que contienen las regiones inmunogénicas principales de ZEBRA, P130 ZEBRA y P125 ZEBRA. P130 ZEBRA corresponde a los aminoácidos 157 a 195 de la proteína ZEBRA, y P125 corresponde a los aminoácidos 59 a 93 de la proteína ZEBRA. Entre los anticuerpos producidos durante el curso de la infección, los anticuerpos contra la proteína ZEBRA son detectados durante un proceso particular denominado reactivación de EBV (Maréchal et al, 1993, Joab et al, 1991, Brousset et al. AIDS, 1994). La serología ha constituido una ayuda importante en el diagnóstico de las infecciones por EBV, mucho antes del descubrimiento del virus en sí mismo, en 1964. La infección con el EBV produce un amplio espectro de anticuerpos para los distintos antígenos, tanto estructurales como no estructurales (Henle W y Henle G, 1981). Durante el curso de la infección, los niveles de anticuerpos para los distintos antígenos del EBV aumentarán y a continuación, disminuirán, proporcionando información válida con respecto al estadio de la infección. Las diferencias individuales en el sistema inmunitario de los pacientes significan que ningún individuo producirá exactamente el mismo perfil de anticuerpos en un momento dado. Sin embargo, la secuencia de la producción de anticuerpos durante el curso de la infección, es suficientemente constante para proporcionar útil información diagnóstica. La aparición de anticuerpos anti-ZEBRA constituye un momento importante durante el diagnóstico serológico de las pedologías asociadas con EBV y durante el seguimiento de los pacientes que presentan una disposición para desarrollar una patología asociada con los pacientes inmunodeprimidos por EBV y con los pacientes que sufran neoplasias asociadas con la infección por EBV. Algunos trabajos han descrito P130 y P125, y la utilización de sus propiedades inmunogénicas como marcadores diagnósticos y pronósticos para la detección de la infección por EBV y durante la progresión de patologías asociadas con la infección por el EBV. El documento WO96/21155 da a conocer un procedimiento para determinar la presencia o ausencia de la proteína P130 ZEBRA durante una infección primaria por EBV. Este documento d aa conocer sólo la utilización de P130 durante las primeras etapas de la enfermedad, pero no durante el segundo repunte de ésta, por ejemplo, la reactivación del EBV. Dardari et al (Dardari et al, 2007) describen el significado pronóstico de las proteínas ZEBRA P125 y P130 durante el carcinoma nasofaríngeo (NPC). Este artículo demuestra que los anticuerpos dirigidos contra P125 se encuentran más en pacientes con NPC, cualquiera que sea su edad, que los anticuerpos dirigidos contra P130. Sin embargo, este artículo no describe el uso de otras proteínas EBV como marcadores pronósticos. El documento WO00/55622 se refiere a una composición farmacéutica que incluye, en particular, la proteína ZEBRA P100, para prevenir la infección por el virus EBV, y para evitar el desarrollo de patologías tales como el linfoma de Burkitt, la enfermedad de Hodgkin y el carcinoma nasofaríngeo. Marechal et al (Research Virology, 1993, vol 144, nº 5, p 397-404), dan a conocer un ensayo ELISA que incluye ZEBRA para el cribado de la reactivación de EBV en los pacientes HIV positivos. Hasta la fecha, no existe un procedimiento que permita de modo eficiente y rápido la detección de la reactivación del virus EBV en pacientes sanos infectados con el virus EBV o en pacientes afectos de patologías asociadas con la infección por EBV. La invención se basa en la inesperada observación de que los anticuerpos IgG contra la proteína ZEBRA P100 aparecen más rápidamente que los anticuerpos contra P130 o cualquier otra proteína del... [Seguir leyendo]

1. Utilización del fragmento ZEBRA P100 constituido por la secuencia SEC ID nº 5 o SEC ID nº 8, para el cribado in vitro y ex vivo de la reactivación del virus EBV en una muestra biológica de un individuo afectado por una patología asociada con la infección por EBV. 2. Utilización según la reivindicación 1, en la que las patologías asociadas con las infecciones por EBV se seleccionan de entre el grupo que comprende: tumores específicos para el huésped inmunocomprometido, tumores del huésped inmunocompetente y el síndrome vírico relacionado con EBV. 3. Procedimiento para la determinación in vitro y ex vivo de la presencia o cantidad de por lo menos un anticuerpo que reconoce específicamente el polipéptido constituido por SEC ID nº 5 o SEC ID nº 8, pudiendo dicho anticuerpo estar presente en una muestra biológica de un individuo afectado por una patología asociada con la infección por EBV. 4. Procedimiento para la determinación in vitro y ex vivo de la presencia o cantidad de por lo menos un anticuerpo según la reivindicación 3, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes: a. poner en contacto la muestra biológica de dicho paciente con dicho polipéptido, b. detectar la formación de un inmunocomplejo entre dicho polipéptido y dicho anticuerpo que puede estar presente en dicha muestra biológica, y c. cuantificar opcionalmente la cantidad del inmunocomplejo formado. 5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el polipéptido se inmoviliza sobre un soporte, preferentemente una placa de microtitulación. 6. Procedimiento según la reivindicación 4 ó 5, en el que dicha detección se lleva a cabo utilizando un anticuerpo que puede detectar el fragmento Fc de dicho anticuerpo. 7. Kit ELISA para la determinación in vitro y ex vivo de la reactivación de EBV en un individuo, que comprende: - por lo menos un polipéptido constituido por la secuencia aminoácida SEC ID nº: 5, o SEC ID nº:8, inmovilizado en una placa ELISA, y - opcionalmente, unos anticuerpos que reconocen el fragmento Fc de los anticuerpos humanos. 19     21