HERRAMIENTA DE TRANSFERENCIA Y DE PRODUCCION DE PROTEINAS QUE UTILIZA EL SISTEMA DE SECRECION DE TIPO III DE PSEUDOMONAS.

Vector de expresión de una proteína quimérica, cuyo extremo N-terminal corresponde a la fusión entre el extremo N-terminal de ExoS de Pseudomonas aeruginosa y una secuencia de aminoácidos de interés,

correspondiendo el extremo N-terminal de ExoS al extremo N-terminal de la proteína quimérica, estando dicho vector caracterizado porque contiene de 5'' a 3'':

- un promotor,

- una secuencia nucleotídica que codifica para los 54 (SEC ID nº 5) primeros aminoácidos del extremo N-terminal de ExoS, o para cualquier secuencia idéntica por lo menos en 75% a SEC ID nº 5,

- una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de interés

Herramienta de transferencia y de producción de proteínas que utiliza el sistema de secreción de tipo III Pseudomonas.

La presente invención se refiere a una nueva herramienta de transferencia en unas células eucariotas o de producción en el sobrenadante de un cultivo bacteriano, de proteínas quiméricas a partir del sistema de secreción de tipo III presente en la bacteria Pseudomonas, en particular Pseudomonas aeruginosa. Más precisamente, la invención se refiere a nuevos vectores de expresión de proteínas quiméricas o, más generalmente, de secuencias de aminoácidos, en P. aeruginosa. Se refiere asimismo a las cepas de P. aeruginosa transformadas con dichos vectores de expresión con vistas a la secreción o a la inyección, mediante el SSTT de P. aeruginosa, de proteínas quiméricas en el sobrenadante de cultivo o en unas células eucariotas respectivamente. Por lo tanto, tiene asimismo por objeto un método de inyección (denominado asimismo translocación) in vitro o ex vivo en unas células eucariotas, de proteínas quiméricas, así como un método de producción de proteínas quiméricas en el sobrenadante de cultivo, métodos que se pueden utilizar con fines terapéuticos.

Las bacterias poseen naturalmente unos sistemas de secreción de proteínas que les permiten enviar a distancia unas enzimas o unas toxinas. Además de estos sistemas, algunas de ellas poseen un sistema de secreción, denominado "de tipo III" (denominado SSTT) que les permiten inyectar directamente unas proteínas tóxicas, desde su citosol hasta el citosol de una célula diana. Este aparato de secreción es un sistema complejo, constituido por un cierto número de elementos que forman un canal que atraviesa la membrana interna, el espacio periplásmico y la membrana externa de la bacteria, permitiendo este canal el paso de toxinas específicas. En la mayoría de las especies bacterianas, este sistema de secreción se puede activar o bien mediante el contacto con la célula eucariota diana, lo que provoca la inyección de las toxinas en el citosol de la célula diana, o bien mediante la quelación del Ca²⁺ en el medio exterior, lo que provoca la secreción de las toxinas específicas en el medio de cultivo.

Por lo tanto, ha parecido interesante estudiar si los sistemas de secreción de tipo III (SSTT) se podían utilizar para la inyección de proteínas de interés en unas células eucariotas fusionando la secuencia nucleotídica que codifica la toxina segregada por el SSTT con una segunda secuencia nucleotídica que codifica una proteína de interés.

Un SSTT se ha descrito en las bacterias del género Yersinia por Cornelis et al. [1] (1997). Este documento indica en efecto que el sistema de secreción de tipo III de Yersinia enterocolitica, denominado Ysc, es capaz de asegurar la secreción y después la translocación en una célula hospedante de proteínas efectoras, en particular YopE y YopH. SORY et al. [2] han estudiado la estructura molecular de las proteínas Yop y han demostrado la presencia, sobre YopE y YopH de tres dominios, respectivamente un dominio N-terminal necesario para la secreción, un dominio necesario para la translocación y una parte C-terminal, responsable de la actividad tóxica de dicha proteína. Estas propiedades han sido demostradas mediante la construcción de proteínas híbridas obtenidas mediante la fusión de la parte amino-terminal de YopE o YopH con una enzima reportera, tal como por ejemplo la adenilcilasa activada por la calmodulina, siendo la actividad enzimática medida a continuación.

El documento US-A-5.965.381 menciona por otro lado el interés de identificar precisamente el tamaño mínimo de la secuencia nucleotídica que codifica la proteína efectora necesaria para la secreción y después para la transferencia de una proteína diana en una célula eucariota. Para ello, el método descrito consiste, de la misma manera que se ha mencionado anteriormente, en fusionar unas secuencias que comprenden un número decreciente de nucleótidos con una secuencia que codifica una enzima reportera activada mediante la calmodulina, demostrando la aparición de una actividad ciclásica en el citosol de la célula translocada la existencia de la translocación. A pesar de que se desprende de la descripción que las construcciones se han realizado a partir de los 50, 71, 100 y 130 primeros aminoácidos de YopE, sólo se ilustra el fragmento de 130 aminoácidos, lo que supone que las demás secuencias de aminoácidos identificadas son demasiado cortas para permitir la secreción y después la translocación de la proteína de interés. En consecuencia, el número elevado de aminoácidos necesario para la secreción (130 aminoácidos) limita, si no impide, la posibilidad de utilizar esta secuencia para la transferencia de proteínas de interés de tamaño importante.

El documento US-B-6.306.387 se refiere a la presencia de un sistema de secreción de tipo III en las bacterias de género Salmonella. Este documento demuestra en particular la posibilidad de translocar, en unas células hospedantes, una proteína quimérica denominada SptP-NPc obtenida mediante la fusión de los 173 aminoácidos N-terminales constitutivos de la proteína quimérica denominada SptP segregada naturalmente por el sistema de tipo III de Salmonella con una secuencia parcial que codifica una nucleoproteica del virus Influenza, siendo la detección realizada por medio de anticuerpos capaces de detectar la proteína quimérica en la célula infectada. En este caso también, la secuencia de aminoácidos de la proteína tóxica inyectada es relativamente larga puesto que no cuenta con menos de cómo mínimo 173 aminoácidos que impiden por lo tanto la transferencia en una célula hospedante, de proteínas grandes fusionadas. En efecto, no siendo las proteínas inyectadas escindidas posteriormente, es necesario disponer de una proteína tóxica de tamaño lo más bajo posible.

La existencia de un sistema de secreción de tipo III ha sido demostrada asimismo en un tercer género de bacterias que es el género Pseudomonas, en particular las bacterias de tipo Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa es un bacilo Gram negativo, patógeno oportunista, responsable de infecciones nosocomiales graves en los hospitales. Constituye asimismo unas de las principales causas de morbidez y de mortalidad en las personas que padecen mucoviscidosis. El sistema de secreción de tipo III de P. aeruginosa constituye un medio de defensa muy eficaz, en particular contra los fagocitos, en particular los granulocitos neutrófilos, primera línea de defensa de la inmunidad celular. Este sistema se utiliza asimismo por la bacteria para inducir la proliferación y la apoptosis de los linfocitos T. Se sabe que P. aeruginosa segrega cuatro toxinas gracias al sistema de secreción de tipo III, denominadas respectivamente ExoS, ExoT, ExoY y ExoU.

ExoS es una proteína cuya secuencia constituida por 454 AA se conoce y se publica en el GenBank. Corriente arriba del gen que codifica ExoS, existe una secuencia nucleotídica que pude codificar una proteína chaperona supuestamente específica de ExoS, denominada "Orf 1". ExoS posee una actividad de ADP-ribosilación ejercida sobre las pequeñas proteínas G de la familia Ras, así como una capacidad para activar las Rho-GTPasas. ExoT posee por su parte asimismo una activdad ADP-ribosilante, sin embargo 100 veces menor que ExoS. Además, se sabe que ExoS y ExoT tienen unas secuencias nucleotídicas idénticas en 75% (según el programa LFASTA, W. R. Pearson y D. J. Lipman PNAS (1998) 85: 2444-2448). El mecanismo de acción de ExoU no se conoce, pero se trata de una citotoxina potente sobre los epitelios y los macrófagos.

El documento Polack [3] se refiere a una cepa natural aislada de P. aeruginosa cuyas características no se mencionan (cepa CHA), transformada con un plásmido pBP31 que contiene esencialmente dos secuencias nucleotídicas fusionadas que corresponden respectivamente a la secuencia nucleotídica que codifica los 129 aminoácidos N-terminales de ExoS y la secuencia que codifica la proteína p67^phox implicada en la reconstrucción de un complejo enzimático NADPH oxidasa. Polack demuestra la capacidad de esta cepa transformada para no sólo segregar la proteína p76 sino también para reconstituir la actividad NADPH oxidasa después de la inyección de la proteína fusionada en el citosol de los linfocitos B-EBV, demostrando de esta manera la actividad intracelular de las proteínas inyectadas. La secuencia de 129 AA de Exo S utilizada por Polack es, por lo tanto, la secuencia más corta jamás...

1. Vector de expresión de una proteína quimérica, cuyo extremo N-terminal corresponde a la fusión entre el extremo N-terminal de ExoS de Pseudomonas aeruginosa y una secuencia de aminoácidos de interés, correspondiendo el extremo N-terminal de ExoS al extremo N-terminal de la proteína quimérica, estando dicho vector caracterizado porque contiene de 5' a 3':

2. Vector según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia nucleotídica codifica para los 54 primeros aminoácidos del extremo N-terminal de ExoT de P. aeruginosa.

3. Vector de clonación que comprende de 5' a 3':

4. Vector de clonación según la reivindicación 3, caracterizado porque la secuencia nucleotídica codifica para los 54 primeros aminoácidos del extremo N-terminal de ExoT de Pseudomonas aeruginosa.

5. Proteína quimérica cuyo extremo N-terminal está constituido por los 54 (SEC ID nº 5) primeros aminoácidos del extremo N-terminal de ExoS, o por cualquier secuencia idéntica por lo menos en 75% a SEC ID nº 5.

6. Proteína quimérica según la reivindicación 5, caracterizada porque su extremo N-terminal está constituido por los 54 primeros aminoácidos del extremo N-terminal de ExoT de P. aeruginosa.

7. Gen que codifica para la proteína quimérica según una de las reivindicaciones 5 ó 6.

8. Cepa aislada de Pseudomonas aeruginosa transformada con el vector de expresión según una de las reivindicaciones 1 a 4.

9. Cepa según la reivindicación 8, caracterizada porque la cepa se modifica mediante deleción o mutación de por lo menos un gen seleccionado de entre los genes que codifican las proteínas ExoS, ExoT, ExoU y ExoY.

10. Cepa según la reivindicación 9, caracterizada porque la cepa ha sido depositada en la CNCM (Institut Pasteur de Paris) con el número I-3090.

11. Procedimiento de inyección ex vivo o in vitro en una célula eucariota de una proteína quimérica según la reivindicación 5 ó 6, o codificada por un vector según una de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende la puesta en contacto de una cepa según una de las reivindicaciones 8 a 10 con la célula eucariota.

12. Procedimiento de producción de una proteína quimérica según la reivindicación 5 ó 6, o codificada por un vector según una de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende las etapas siguientes:

13. Cepa según una de las reivindicaciones 8 a 10 para su utilización en terapia.