Uso de una ribonucleasa de la familia T2 que tiene actividad de unión a actina para inhibir angiogénesis tumoral.

Una ribonucleasa de la familia T2 para uso en la inhibición de la angiogénesis tumoral en un sujeto,

en donde laribonucleasa de la familia T2 se une a actina en su forma ribonucleolítica activa o no activa, en donde dicharibonucleasa se caracteriza por un peso molecular de la proteína T2 de 24 a 36 kDa y un pH óptimo para actividadRNasa.

Uso de una ribonucleasa de la familia T2 que tiene actividad de unión a actina para inhibir angiogénesis tumoral

Campo y antecedentes de la invención La presente invención se refiere al uso de una ribonucleasa de la familia T2 o un polinucleótido que la codifica para inhibir la angiogénesis tumoral en un sujeto. La presente divulgación se refiere además a composiciones farmacéuticas que contienen, como principio activo, una ribonucleasa de la familia T2 o un polinucleótido que la codifica para tratar enfermedades o trastornos proliferativos en general y cáncer en particular.

Existe un interés continuado, tanto dentro de la comunidad médica como entre la población general, en el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades y trastornos proliferativos celulares tales como cáncer.

Los agentes que presentan propiedades antiproliferativas, anticolonización, antidiferenciación y/o antidesarrollo frente a células de mamífero pueden potencialmente usarse como fármaco antineoplásicos. Como tales, estos agentes se buscan ampliamente desde fuentes tanto naturales como sintéticas.

Las RIBASAS son ribonucleasas (RNasas) que presentan una actividad biológica que es distinta de su capacidad para degradar ARN. Se sabe que las RIBASAS y sus homólogos estructurales efectúan un gran número de reacciones celulares (Rybak, M. y col., 1991, J. Biol. Chem. 266: 21202-21207; Schein, C. H. 1997 Nature Biotechnol. 15: 529-536) . Se cree que EDN y ECP, dos proteínas principales halladas en los gránulos secretores de eosinófilos citotóxicos (miembros de la familia de RNasa A) participan en la respuesta inmune. Las S-RNasas estilares de plantas autoincompatibles (miembros de la familia de RNasa T2) , detienen el crecimiento del tubo polínico y de este modo evitan la fertilización. La RC-RNasa, producida por oocitos de rana toro, inhibe, in vitro, el crecimiento de células tumorales tales como las líneas celulares de leucemia P388 y L1210 y es eficaz para la destrucción in vivo de células de sarcoma 180, Erlich y líquido ascítico Mep II (Chang, C-F. y col 1988, J. Mol Biol

283: 231-244) . Algunas RNasas presentan actividad ribonucleasa limitada, un ejemplo de la cual incluye angiogeninas que estimulan la formación de vasos sanguíneos (Fett, J. W. 1985, Biochemistr y 24: 5480-5486) .

Los organismos vivos usan RNasas extracelulares para defensa contra patógenos y células tumorales. Por ejemplo, se secreta ECP en respuesta a ataque de parásitos (Newton, DL. 1992, J. Biol. Chem. 267: 19572-19578) y presenta actividad antibacteriana y antiviral. Esta actividad también se presenta por Cinc-a2-glicoproteína (Zna2gp) , una RNasa presente en la mayoría de los fluidos corporales humanos incluyendo sangre, plasma seminal, leche materna, fluido sinovial, saliva, orina y sudor (Lei G, y col., 1998, Arch Biochem Biophys. 15 Jul; 355 (2) : 160-4) .

Se desconoce el mecanismo específico por el que las RNasas extracelulares actúan en reacciones celulares.

La principal barrera para la actividad citotóxica de algunas RNasas es la membrana celular. Se ha descubierto que ECP forma canales en membranas tanto artificiales como celulares. Supuestamente, ECP liberada de la membrana granular junto con EDN (RNasa eosinófila, que es responsable de la destrucción de células de Purkinjie cerebelares) transfiere EDN al espacio intercelular. La entrada de la toxina fúngica a-sarcina (un miembro de la familia de RNasa A) en células diana depende de infección viral que permeabiliza la membrana celular (Rybak, M. y col., 1991, J. Biol. Chem. 266: 21202-21207) . También es posible que las RNasas entren en la célula mediante endocitosis. Cuando se usaron los fármacos que alteran el Golgi ácido retinoico o monensina para suministrar de forma artificial BS-RNasa a las células, la citotoxicidad aumentó drásticamente (Wu Y, y col., 1995, J Biol Chem. 21; 270 (29) : 17476-81) .

Puede usarse la citotoxicidad de las RNasas para fines terapéuticos. La RNasa humana L se activa por interferón e inhibe el crecimiento viral. La expresión del gen para RNasa L humana junto con el de una 2’5’-A sintetasa en plantas del tabaco es suficiente para proteger a las plantas de virus del mosaico del pepino y para evitar la replicación del virus de la patata Y. El virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) induce bloqueo en las rutas antivirales de RNasa L (Schein, C. H. 1997 Nature Biotechnol. 15: 529-536.) . Las RNasas pueden fusionarse con anticuerpos de proteína de membrana específicos para crear inmunotoxinas. Por ejemplo, la fusión de RNasa con anticuerpos para el receptor de transferrina o para el antígeno de linfocitos T CD5 conduce a la inhibición de la síntesis proteica en células tumorales que portan un receptor específico para cada una de las toxinas anteriores (Rybak, M. y col., 1991, J. Biol. Chem. 266: 21202-21207; Newton DL, y col., 1998, Biochemistr y 14; 37 (15) : 517383) . Puesto que las RNasas son menos tóxicas para animales, estas pueden tener menos efectos secundarios indeseables que las inmunotoxinas usadas en la actualidad.

La citotoxicidad de las ribonucleasas citotóxicas parece estar relacionada inversamente con la fuerza de la interacción entre un inhibidor de ribonucleasa (RI) y la RNasa. El inhibidor de ribonucleasa (RI) es una molécula de origen natural hallada dentro de células de las vértebras que sirve para proteger estas células de los efectos potencialmente letales de las ribonucleasas. El inhibidor de ribonucleasa es una proteína citosólica de 50 kDa que se une a RNasas con diversa afinidad. Por ejemplo, el RI se une a miembros de la superfamilia de la ribonucleasa pancreática bovina A (RNasa A) de ribonucleasas con constantes de inhibición que abarcan diez órdenes de magnitud, con Ki que varían de 10-6 a 10-16 M.

A-RNasas La ONCONASA, como RNasa A y BS-RNasa, es un miembro de la superfamilia de RNasa A. Los miembros de la superfamilia de RNasa A comparten aproximadamente el 30 % de identidad en secuencias de aminoácidos. La mayoría de los restos no conservados se localizan en bucles superficiales y parecen desempeñar un papel significativo en la actividad biológica dedicadaza de cada RNasa. La ONCONASA se aisló de oocitos y embriones tempranos de rana Leopardo (Rana pipiens) . Tiene efecto antitumoral en una diversidad de tumores sólidos, tanto in situ como in vivo (Mikulski S. M., y col., 1990 J. Natl. Cancer 17; 82 (2) : 151-3) . También se ha descubierto que la ONCONASA inhibe específicamente la replicación de VIH-1 en células de leucemia H9 infectadas a concentración no citotóxica (Youle R. J., y col., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 21; 91 (13) : 6012-6) .

Aunque la actividad RNasa de ONCONASA es relativamente baja, se acepta que las actividades enzimáticas y citotóxicas de la misma están asociadas en cierto grado. Se cree que la estructura terciaria de las A-RNasas diferencia entre tipos citotóxico y no citotóxico. Por ejemplo, se cree que las diferencias entre la estructura terciaria de onconasa y RNasa A son responsables de la citotoxicidad aumentada observada para ONCONASA. La ONCONASA, a diferencia de RNasa A, contiene un resto Glu 1 N terminal bloqueado (piroglutamato) es esencial para la actividades tanto enzimáticas como citotóxicas. Esta estructura única permite a la ONCONASA permear en células diana (Boix E., y col., 1996, J. Mol. Biol. 19: 257 (5) : 992-1007) . Además, en la ONCONASA el resto Lys9 reemplaza el resto Gln11 de RNasa A, que se cree que efectúa la estructura del sitio activo. Además, las diferencias en la secuencia de aminoácidos de la estructura primaria entre ONCONASA y RNasa A provocan cambios topológicos en la periferia del sitio activo que efectúan la especificidad del mismo (Mosimann S. C., y col., 1992, Proteins 14 (3) : 392-400) .

Las diferencias de citotoxicidad entre las A-RNasas también se atribuyen a su capacidad para unirse a RI. La ribonucleasa seminal bovina (BS-RNasa) es el 80 % idéntica en su secuencia de aminoácidos a RNasa A, pero a diferencia de otros miembros de la superfamilia de RNasa A, la BS-RNasa existe en forma dimérica. Se ha mostrado que la estructura cuaternaria de BS-RNasa evita la unión con RI, permitiendo de este modo que la enzima conserve su actividad ribonucleolítica en presencia de RI (Kim y col., 1995, J. Biol. Chem. 270 Nº 52: 31097-31102) . La ONCONASA, que comparte un alto grado de homología con RNasa A, es resistente a unión con RI. El complejo RI-ONCONASA tiene una Kd al menos cien millones de veces menor que la del complejo RI-RNasa A. La menor afinidad de unión de ONCONASA por RI evita la inhibición eficaz de la actividad ribonucleolítica y podría explicar por qué la ONCONASA es citotóxica a concentraciones bajas mientras... [Seguir leyendo]

1. Una ribonucleasa de la familia T2 para uso en la inhibición de la angiogénesis tumoral en un sujeto, en donde la ribonucleasa de la familia T2 se une a actina en su forma ribonucleolítica activa o no activa, en donde dicha ribonucleasa se caracteriza por un peso molecular de la proteína T2 de 24 a 36 kDa y un pH óptimo para actividad RNasa.

2. Un polinucleótido que codifica y es capaz de expresar in vivo una ribonucleasa recombinante de la familia T2 para uso en la inhibición de la angiogénesis tumoral en un sujeto, en el que la ribonucleasa de la familia T2 se une a actina en su forma ribonucleolítica activa o no activa.

3. La ribonucleasa de la reivindicación 1 o el polinucleótido de la reivindicación 2, en el que dicha angiogénesis tumoral se asocia con células que proliferan de forma anómala asociadas con un trastorno o una enfermedad proliferativos seleccionados del grupo que consiste en papiloma, blastoglioma, sarcoma de Kaposi, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer ovárico, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, astrocitoma, cáncer de cabeza, cáncer de cuello, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer pancreático, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, leucemia, linfoma, enfermedad de Hodgkin, enfermedad de Burkitt.

4. La ribonucleasa de la reivindicación 1 o el polinucleótido de la reivindicación 2 o 3 en donde dicha ribonucleasa de la familia T2 se selecciona del grupo que consiste en RNasa HI0526, RNasa I, RNasa T2, RNasa Rh, RNasa M, RNasa Trv, RNasa Irp, RNasa Irp1, RNasa Le2, RNasa Phyb, RNS2, RNasa 3, RNasa 1, RNasa LE, RNasa LX, S-RNasa, RNasa MC, RNasa CL1, RNasa Bsp1, RNasa RCL2, RNasa Dm, RNasa Oy, RNasa Tp y RNasa 6P1.

5. La ribonucleasa de la reivindicación 1 o el polinucleótido de la reivindicación 2, en donde dicha angiogénesis tumoral se asocia con un tumor maligno.

6. La ribonucleasa de la reivindicación 1 o 5 o el polinucleótido de la reivindicación 2, en donde dicha angiogénesis tumoral se asocia con un tumor primario.

7. La ribonucleasa de la reivindicación 1 o 6 o el polinucleótido de la reivindicación 2, en donde dicha ribonucleasa de la familia T2 es RNasa T2 de A. niger.

8. La ribonucleasa de la reivindicación 1 o 7 o el polinucleótido de la reivindicación 2, en donde dicha ribonucleasa de la familia T2 está desprovista de actividad ribonucleasa.

9. La ribonucleasa de la reivindicación 1 u 8 o el polinucleótido de la reivindicación 2, en donde una actividad de unión a actina de dicha proteína ribonucleasa es estable frente a ebullición.

10. La ribonucleasa de la reivindicación 1 o 9 o el polinucleótido de la reivindicación 2, en donde dicha angiogénesis tumoral es angiogénesis de un tumor metastásico.

11. Una ribonucleasa de la familia T2 para uso en el tratamiento de una afección asociada con proliferación celular anómala en un sujeto, en donde la ribonucleasa de la familia T2 se une a actina en su forma ribonucleolítica activa o no activa, en donde dicha ribonucleasa se caracteriza por un peso molecular de la proteína T2 de 24 a 36 kDa y un pH ácido óptimo para actividad RNasa, y en donde dicha afección se selecciona del grupo que consiste en artritis, artritis reumatoide, retinopatía diabética, reestenosis, reestenosis en endoprótesis vascular y reestenosis en injerto vascular.

12. Un polinucleótido que codifica y es capaz de expresar in vivo una ribonucleasa recombinante de la familia T2 para uso en el tratamiento de una afección asociada con proliferación celular anómala en un sujeto, en donde la ribonucleasa de la familia T2 se une a actina en su forma ribonucleolítica activa o no activa, en donde dicha ribonucleasa se caracteriza por un peso molecular de la proteína T2 de 24 a 36 kDa y un pH ácido óptimo para actividad RNasa, y en donde dicha afección se selecciona del grupo que consiste en artritis, artritis reumatoide, retinopatía diabética, reestenosis, reestenosis en endoprótesis vascular y reestenosis de injerto vascular.