Uso de la endoglucosidasa EndoS para el tratamiento de enfermedades mediadas por la inmunoglobulina G.

Un polipéptido EndoS, o un polinucleótido que codifica un polipéptido EndoS,

para su uso en un método para eltratamiento o la prevención de una enfermedad o afección mediada por anticuerpos de IgG, donde dichaenfermedad o afección es una enfermedad autoinmunitaria, rechazo de trasplante o hemofilia adquirida.

Uso de la endoglucosidasa EndoS para el tratamiento de enfermedades mediadas por la inmunoglobulina G

Campo de la invención La presente invención se refiere a un método para el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por anticuerpos de IgG, donde dicha enfermedad o afección es una enfermedad autoinmunitaria, rechazo de trasplante o hemofilia adquirida.

Antecedentes de la invención La IgG es un heterotretámero compuesto por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras unidas entre sí mediante enlaces disulfuro formando tres dominios de proteína separados por una región bisagra flexible y sensible a proteasas. Las dos partes Fab idénticas se unen a antígenos y la única parte Fc es responsable de las funciones efectoras, incluyendo la unión y la activación del factor del complemento C1q y de receptores de Fc en leucocitos.

Además de la estructura polipeptídica, la parte Fc contiene un glucano conservado en cada cadena pesada unido a Asn-297. Este oligosacárido es de tipo biantenario complejo con una fucosa núcleo unida a la N-acetilglucosamina (GlcNAc) más interna. Estos glucanos se localizan en la interfaz entre los dominios CH2 (segundo dominio constante de las cadenas pesadas) .

La EndoS es una endoglucosidasa segregada por el patógeno humano Streptococcus pyogenes. La EndoS hidroliza específicamente el glucano unido a la asparagina en la IgG entre los dos restos núcleo de GlcNAc. A diferencia de muchas endoglucosidasas relacionadas que requieren o que están mejoradas por desnaturalización del sustrato glucoproteínico, la EndoS solo hidroliza a la IgG natural. Hasta ahora no se ha encontrado ningún otro sustrato para la EndoS.

Sumario de la invención Los autores de la presente invención han demostrado que la EndoS es útil en el tratamiento y prevención de enfermedades mediadas por anticuerpos de IgG. En particular, los inventores han demostrado que la EndoS hidroliza eficazmente la IgG en sangre humana e in vivo en conejos, que la desglucosilación de la IgG por la EndoS anula su capacidad inductora de artritis en ratones, y que la EndoS tiene un efecto protector en un modelo de ratón de púrpura trombocitopénica idiopática (PTI) letal dirigida por IgG. El tratamiento previo de anticuerpos patógenos con EndoS inhibe el desarrollo de esta enfermedad, y la enzima también salva a ratones de enfermedades ya establecidas cuando se ha desarrollado trombocitopenia grave y sangrado subcutáneo.

Por tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona el uso de un polipéptido EndoS, o un polinucleótido que codifica un polipéptido EndoS, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por anticuerpos de IgG, donde dicha enfermedad o afección es una enfermedad autoinmunitaria, rechazo de trasplante o hemofilia adquirida.

La presente invención también proporciona:

-un péptido EndoS, o un polinucleótido que codifica un polipéptido EndoS, para su uso en un método para el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por anticuerpos de IgG; donde dicha enfermedad o afección es una enfermedad autoinmunitaria, rechazo de trasplante o hemofilia adquirida; y -un método de tratamiento, ex vivo, de sangre extraída de un paciente que padece una enfermedad o afección mediada por anticuerpos de IgG, donde dicha enfermedad o afección es una enfermedad autoinmunitaria, rechazo de trasplante o hemofilia adquirida, y donde dicho método comprende poner en contacto la sangre con un polipéptido EndoS.

Breve descripción de las figuras 55 La Figura 1A es un modelo estructural de la IgG1 humana. Los corchetes indican la parte Fab de unión a antígeno y la parte Fc efectora Fc de la IgG. La flecha indica los dos glucanos conservados unidos a Asn-297 de las cadenas pesadas. La Figura 1B es una representación esquemática del glucano de la cadena pesada de la IgG completamente sustituido. S2 indica la glucoforma completamente sialilada, G0 y el corchete indican la extensión de la glucoforma G0. LCA indica el sitio de unión para la aglutinina de Lens culinaris usada en experimentos con lectina y EndoS indica el sitio de escisión para la enzima. La Figura 2 es un alineamiento de secuencia de aminoácidos ClustalW de homólogos de EndoS de diferentes serotipos de S. pyogenes, S. equi y S. zooepidemicus. Los nombres de las cepas, especies y serotipos M se muestran a la izquierda. Las identidades y similitudes de aminoácidos se muestran en gris y la secuencia 65 consenso se muestra debajo del alineamiento. El motivo de quitinasa conservado se indica en un recuadro y el ácido glutámico esencial para la actividad se marca con un asterisco por debajo del alineamiento.

La Figura 3 es un alineamiento de secuencia de aminoácidos ClustalW del dominio ! de la EndoS con EndoF2 de Elizabethkingia meningoseptica y CP40 de Cor y nebacterium pseudotuberculosis. Los nombres de las proteínas se muestran a la izquierda. Las identidades y similitudes de aminoácidos se muestran en gris y la secuencia consenso se muestra debajo del alineamiento. El motivo de quitinasa conservado se indica en un recuadro y el ácido glutámico esencial para la actividad se marca con un asterisco por debajo del alineamiento. La Figura 4 muestra la representación esquemática de la organización de dominios de la EndoS de los 995 aminoácidos de la EndoS de longitud completa (SEC ID Nº: 2) . Ss indica el péptido de señal, en el dominio ! se indica el motivo del sitio activo de la familia quitinasa 18 y el sitio de escisión de SpeB que genera los dos dominios se indica con una flecha. La Figura 5 muestra un análisis de actividad de la EndoS en sangre humana. La Figura 5A muestra un análisis SDS-PAGE de IgG purificada de sangre humana incubada con concentraciones en aumento de EndoS recombinante (rEndoS) . La Figura 5B muestra un análisis de transferencia de lectina LCA de IgG purificada de sangre humana completa incubada con concentraciones en aumento de rEndoS. La Figura 5C muestra un análisis densitométrico de la transferencia de lectina sobre IgG purificada de sangre humana incubada con concentraciones en aumento de rEndoS. La Figura 6 muestra un análisis de la actividad in vivo de la EndoS en conejos. La Figura 6A muestra un análisis de SDS-PAGE (tinción) y de transferencia de lectina (transferencia de LCA) de IgG purificada de muestras de suero extraídas del conejo en el momento indicado después de la primera inyección intravenosa de 500 ∀g de rEndoS. La Figura 6B muestra un análisis de SDS-PAGE (tinción) y de transferencia de lectina (transferencia de LCA) de IgG purificada de muestras de suero extraídas del conejo en el momento indicado después de una segunda administración de rEndoS. La Figura 6G muestra un análisis de SDS-PAGE (tinción) y de transferencia de lectina (transferencia de LCA) de IgG purificada de muestras de suero extraídas del conejo en el momento indicado después de una tercera administración de rEndoS. La Figura 7 muestra la respuesta de anticuerpos del conejo contra rEndoS. Las muestras de suero se extrajeron del conejo en el momento indicado después de la primera, segunda y tercera inyección de rEndoS. Los sueros se usaron como antisueros primarios en una transferencia de Western sobre diferentes tiras de membranas con rEndoS purificada separada por SDS-PAGE. La Figura 7A también muestra la respuesta de anticuerpos del conejo contra rEndoS. Las muestras de suero son las mismas que las de la Figura 7. Inserto: transferencia de Western como en la Figura 7 usando, como antisuero primario, las muestras de suero después de la primera inyección. Figura principal: se usaron muestras de suero después de la primera, segunda y tercera inyección como antisuero primario en un experimento ELISA con la EndoS inmovilizada. Se presenta el aumento de concentración (ng/ml) de IgG anti-EndoS comparado con la concentración antes de la primera inyección. Se muestra un experimento representativo. La Figura 8 muestra un análisis de SDS-PAGE (tinción) y de transferencia de lectina (transferencia) de anticuerpos IgG monoclonales (CIIC1 y M2139) incubados con y sin EndoS y separados por SDS-PAGE al 10%. Los geles se analizaron mediante tinción con Azul de Coomassie (tinción) o mediante transferencia a una membrana que se exploró con lectina GNL (transferencia) . El anticuerpo monoclonal CIIC (IgG2a) se incubó con EndoS (carril 1) y sin EndoS (carril 2) ; el anticuerpo monoclonal M2139 (IgG2b) se incubó con EndoS (carril 3) y sin EndoS (carril 4) . La Figura 9 muestra secciones articulares (10 ∀m) de ratas tratadas con anticuerpos de unión a CII normales y tratados con EndoS: (a) M2139, (b) M2139D, (c) CIIC1, (d) CIIC1D y (e) control; y teñidas. El aumento es x10. Los anticuerpos desglucosilados... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido EndoS, o un polinucleótido que codifica un polipéptido EndoS, para su uso en un método para el

tratamiento o la prevención de una enfermedad o afección mediada por anticuerpos de IgG, donde dicha 5 enfermedad o afección es una enfermedad autoinmunitaria, rechazo de trasplante o hemofilia adquirida.

2. Un polipéptido o polinucleótido para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho polipéptido EndoS comprende:

(a) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1;

(b) una variante de la misma que tiene una identidad de al menos el 50% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 y que tiene actividad IgG endoglucosidasa; o

(c) un fragmento de cualquiera de las mismas que tiene actividad IgG endoglucosidasa.

3. Un polipéptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, que consiste en la secuencia mostrada en la SEC ID Nº: 1.

4. Un polinucleótido para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

(a) la secuencia codificante de la SEC ID Nº: 3;

(b) una secuencia que, como resultado del código genético, está degenerada con respecto a la secuencia definida en (a) ;

(c) una secuencia que tiene una identidad de al menos el 60% con una secuencia definida en (a) o en (b) y que codifica un polipéptido que tiene actividad IgG endoglucosidasa; o

(d) un fragmento de una cualquiera de las secuencias definidas en (a) , (b) o (c) , que codifica un polipéptido que tiene actividad IgG endoglucosidasa.

5. Un polinucleótido para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, que consiste en la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID Nº: 3. 30

6. Un polipéptido o polinucleótido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha enfermedad autoinmunitaria es enfermedad de Addison, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolipídico, anemia aplásica, gastritis autoinmunitaria, sordera autoinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, hipoparatiroidismo autoinmunitario, hipofisitis autoinmunitaria, enfermedad 35 autoinmunitaria del oído interno, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario, miocarditis autoinmunitaria, ooforitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, poliendocrinopatía autoinmunitaria, enfermedad de Bechet, penfigoide bulboso, cardiomiopatía, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, enfermedad celiaca, enfermedad de Crohn, síndrome de CREST, enfermedad de Degos, epidermólisis ampollosa adquirida, crioglobulinemia mixta esencial, arteritis de células gigantes, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, 40 enfermedad de Grave, síndrome de Guillan-Barre, tiroiditis de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Kawasaki, síndrome de Meniere, enfermedad mixta del tejido conectivo, úlcera de Mooren, esclerosis múltiple, miastenia grave, pénfigo foliáceo, pénfigo vulgaris, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, síndrome autoinmunitario poliglandular de tipo 1 (PAS-1) , síndrome autoinmunitario poliglandular de tipo 2 (PAS-2) , síndrome autoinmunitario poliglandular de tipo 3 (PAS-3) ,

polimiositis/dermatomiositis, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, síndrome de Raynaud, síndrome de Reiter, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjörgen, tiroiditis subaguda, oftalmia simpática, lupus eritematoso sistémico, arteritis de Takayasu, diabetes mellitus de tipo 1, vitíligo, enfermedad de VogtKoyanagi-Harada o granulomatosis de Wegener.

7. Un polipéptido o polinucleótido para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicha enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide.

8. Un polipéptido o polinucleótido para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicha enfermedad

autoinmunitaria es lupus eritematoso sistémico. 55

9. Un polipéptido o polinucleótido para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicha enfermedad autoinmunitaria es púrpura trombocitopénica idiopática.

10. Un polipéptido o polinucleótido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde 60 dicho rechazo de trasplante es rechazo de aloinjerto o de xenoinjerto.

11. Un polipéptido EndoS, o un polinucleótido que codifica un polipéptido EndoS, para su uso en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por anticuerpos de IgG, donde dicha enfermedad o afección es una enfermedad autoinmunitaria, rechazo de trasplante o hemofilia adquirida.

12. Un método de tratamiento, ex vivo, de sangre extraída de un paciente que padece una enfermedad o afección mediada por anticuerpos de IgG, donde dicha enfermedad o afección es una enfermedad autoinmunitaria, rechazo de trasplante o hemofilia adquirida y donde dicho método comprende poner en contacto la sangre con un polipéptido EndoS.