Uso de dendrímeros carbosilanos aniónicos para la separación de proteínas.

Uso de dendrímeros carbosilanos aniónicos para la separación de proteínas.

La invención se refiere al uso de dendrímeros carbosilanos aniónicos como nanoaditivos en electroforesis capilar para la separación de proteínas, más preferiblemente para la obtención de perfiles proteicos y aún más preferiblemente para la identificación de alimentos.

Uso de dendrimeros carbosilanos anionicos para la separación de proteínas.

La presente invención se refiere al uso de dendrímeros aniónicos como nanoaditivos en electroforesis capilar (CE) para la separación de proteínas, más concretamente para la obtención de perfiles proteicos que resultan de utilidad en la caracterización de alimentos.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La CE es una técnica de análisis poderosa debido a su aplicabilidad en el análisis de grandes macromoléculas como las proteínas en el campo alimentario. Los estudios dedicados al análisis de las proteínas de los alimentos por CE se han centrado en el análisis cuantitativo de las proteínas más importantes a nivel nutricional en diferentes productos alimenticios así como en el análisis de proteínas para determinar la calidad y autenticidad de un alimento. Además, este análisis por CE ha permitido la detección de adulteraciones y la identificación de variedades de diferentes cultivos.

En este contexto, la cromatografía electrocinética (EKC) es un modo de separación muy útil para el análisis de las proteínas. En este modo de CE, los analitos se separan en función de su afinidad relativa por una fase pseudoestacionaria. La fase pseudo-estacionaria más empleada en EKC hasta la fecha son las micelas convencionales de surfactantes, como SDS. Otra opción para la separación electrocinética es el uso de polímeros solubles que migran en contra del flujo electroosmótico (EOF) . Así, un ejemplo de estos polímeros son los dendrímeros, macromoléculas con estructuras tridimensionales que han mostrado una enorme aplicabilidad y cuya mayor ventaja se basa en su versatilidad para modificar su esqueleto y superficie. Aunque CE se ha empleado también en el análisis de dendrímeros para caracterizar nuevos dendrímeros o modificaciones de dendrímeros ya existentes y como recubrimiento para algunas columnas de CE para mejorar las eficacias de separación, el empleo de los dendrímeros como fase pseudo-estacionaria en EKC ha sido muy poco estudiado. Algunas de estas aplicaciones están recogidas en dos artículos de revisión (C. P. Palmer, J. P. McCarney, Electrophoresis 25 (2004) 4086–4094; M. Castagnola,

C. Zuppi, D. V. Rossetti, F. Vincenzoni, A. Lupi, A. Vitali, E. Meucci, I. Messana, Electrophoresis 23 (2002) 17691778) .

Es conocido que los dendrímeros pueden interaccionar con las proteínas. Estas interacciones dependerán de la estructura del dendrímero, de los grupos existentes en su superficie y del pH del medio. Por ejemplo, existen estudios de la interacción entre dendrímeros carbosilanos, con grupos amonio o amino en la superficie, y una proteína como la albúmina de suero bovino (BSA) empleando quenchers flourescentes, no observando cambios conformacionales en la proteína debido a esta interacción. Los análisis a nivel estructural mostraron que estos dendrímeros se unían a BSA via interacciones hidrofílicas e hidrofóbicas (E. Pedziwiatr, D. Shcharbin, L. Chonco, P. Ortega, F. J. de la Mata, R. Gómez, B. Klajnert, M. Br y szewska, M. A. Muñoz-Fernandez, J. Fluoresc. 19 (2009) 267275) . Realizando el análisis con dendrímeros tipo PAMAM (J. S. Mandeville, H. A. Tajmir-Riahi, Biomacromolecules 11 (2010) 465-472) , estas interacciones pueden dar lugar a la formación de complejos estables.

Por otro lado, se ha descrito el uso de dendrímeros catiónicos y aniónicos Starburst PAMAM de diferentes generaciones para mejorar la separación de proteínas en CE y de esta manera mejorar los perfiles de proteínas de pollo sarcoplásmico (C. Stathakis, E. A. Arriaga, N. J. Dovichi, J. Chromatogr. A 817 (1998) 233–238) . Además, existe otro trabajo donde se ha examinado la influencia de dendrímeros catiónicos PAMAM en la separación de patrones de proteínas por CE (Q. Liu, J. Tian, C. Zhang, H. Yang, Y. Liu, W. Qin, Z. Liu, Electrophoresis 32 (2011) 1302-1308) .

Por lo tanto, resulta muy interesante y prometedor el estudio de nuevos dendrímeros solubles en agua para investigar su efecto en la separación de proteínas por EKC y en la mejora de los perfiles proteicos. Estos perfiles constituyen una herramienta de análisis muy útil para la diferenciación y clasificación de diversos alimentos. La utilidad de estos perfiles depende de la reproducibilidad del método electroforético y del número de picos resueltos que se obtienen, ya que esto permite una total comparación de diversos perfiles y asegura la especificidad de los mismos.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En la presente invención se describen dendrímeros carbosilano con un interior constituido por enlaces carbonosilicio y una superficie cargada negativamente, empleando CE y una valoración potenciométrica. Estos dendrímeros se evaluaron como nanoaditivos en EKC para la mejora de los perfiles proteicos. Por tanto, los dendrímeros empleados en la presente invención se proponen como atractivos nanoaditivos para la separación de proteínas vegetales por EKC ya que permiten una clara mejora de los perfiles proteicos.

La utilización de los dendrímeros utilizados en la presente invención, es decir, de dendrímeros de estructura carbosilano funcionalizados con grupos aniónicos en la superficie es interesante puesto que estos sistemas tienen

-

una superficie hidrofílica debido a las cargas negativas de los grupos terminales (COO-, SO3 o PO32-) y que le confieren solubilidad en agua, pero al mismo tiempo presentan un esqueleto con carácter hidrofóbico. La ambifilía de estos sistemas conduce a interacciones con proteínas más eficientes que las que presentan por ejemplo los dendrímeros aniónicos Starburst PAMAM descritos en el estado de la técnica, ya que estos carecen de ese carácter hidrofóbico.

Los perfiles proteicos se han convertido en una herramienta muy importante en la diferenciación y clasificación de variedades de diversos alimentos, así como en la obtención de “huellas dactilares” específicas para ellas. El correcto empleo de estos perfiles proteicos está condicionado a conseguir una buena eficacia de separación para obtener diversos picos y bien resueltos. Así, a modo de ejemplo los dendrímeros carbosilano, con un interior constituido por enlaces carbono-silicio y una superficie cargada negativamente debido a los grupos carboxilato que presenta como grupos funcionales, se emplean con éxito como nanoaditivos para separar las proteínas de soja y de semilla de aceituna. Primero, estos dendrímeros fueron caracterizados empleando CE para determinar sus posibles impurezas de reacción. Por medio de una valoración potenciométrica, se determinaron sus pKa. Posteriormente, estos dendrímeros carbosilano se emplearon para mejorar los perfiles proteicos de distintas proteínas vegetales, obtenidos por EKC. Se probaron distintas generaciones de dendrímero (G0, G1 y G2) así como diferentes concentraciones (0, 01-1% m/v) . La generación más grande (G2) a una concentración de 0, 1% (m/v) permitió observar los mejores perfiles proteicos de soja y semillas de aceituna. Estos resultados demuestran que los dendrímeros carbosilano con grupos aniónicos, en concreto grupos carboxilato, fosfato o sulfato, en la superficie son una atractiva alternativa como nanoaditivos en EKC para la separación efectiva de proteínas vegetales.

Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de un dendrímero carbosilano aniónico que comprende:

-un núcleo polifuncional y

-una capa externa, que consiste, total o parcialmente, en unidades iguales o diferentes del grupo de 25 fórmula (I) :

-Si-Xp

'

(R ) 3-p

(I)

donde: R ’ es un grupo alquilo (C1-C4) , p varía entre 1 y 3, y X es el siguiente grupo de fórmula (II) :

- E-N- (CH2) z-R1 2

(II) donde: E es un grupo enlazante entre el silicio y el grupo amina, z varía entre 1 y 4, 35 R1 se selecciona de un grupo de la lista que comprende –COO-, -SO3-o -PO32-, o cualquiera de sus sales; como nanoaditivo en electroforesis capilar para la separación de proteínas.

Mediante referencia se incluye cualquiera de las realizaciones preferidas de los dendrímeros aniónicos, con grupos carboxilato, fosfato o sulfato, descritos en la solicitud internacional WO2011/101520, además de cualquiera de sus sales, preferiblemente las alcalinas o alcalinotérreas, y más preferiblemente las de sodio.

En una realización preferida del uso de la presente invención, el núcleo de los dendrímeros es de silicio o polifenólico según se describe en la solicitud internacional WO2011/101520, más preferiblemente el núcleo es de 45 silicio.

En otra realización preferida, E se selecciona entre un alquilo (C1-C10) o un grupo –... [Seguir leyendo]

1. Uso de un dendrímero carbosilano aniónico que comprende:

- un núcleo polifuncional y

-una capa externa, que consiste, total o parcialmente, en unidades iguales o diferentes del grupo de fórmula (I) :

-Si-Xp

(R') 3-p

(I)

donde: R ’ es un grupo alquilo (C1-C4) , p varía entre 1 y 3, y X es el siguiente grupo de fórmula (II) :

- E-N- (CH2) z-R1

(II) donde: E es un grupo enlazante entre el silicio y el grupo amina, 15 z varía entre 1 y 4, R1 se selecciona de un grupo de la lista que comprende –COO-, -SO3-o -PO32-, o cualquiera de sus sales; como nanoaditivo en electroforesis capilar para la separación de proteínas.

2. Uso según la reivindicación 1, donde el núcleo es de silicio.

3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde p es 1.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde R’ es metilo. 25

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde E se selecciona entre un alquilo (C1-C10) o un grupo – (CH2) x-R3, donde R3 es un grupo triazol o fenoxo y x varia entre 1 y 6.

6. Uso según la reivindicación anterior, donde E es propilo.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el dendrímero es de generación cero, uno o dos.

8. Uso según la reivindicación anterior, donde el dendrímero es de segunda generación.

9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde R1 es -COO-.

10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde z es 2.

11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde las sales son alcalinas o alcalinotérreas.

12. Uso según la reivindicación anterior donde las sales son de sodio.

13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el dendrímero tiene una concentración de entre

0, 01 y 0, 5 % (m/v) . 45

14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde las proteínas son vegetales.

15. Uso según la reivindicación anterior, donde las proteínas son de soja o de aceituna.

16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la obtención de perfiles proteicos.

17. Uso según la reivindicación anterior, para la caracterización de un alimento.

18. Kit que comprende un dendrímero carbosilano aniónico según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 55 anteriores y un tampón básico.

19. Kit según la reivindicación anterior, donde el tampón es de pH de entre 8 y 9, 5.

20. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 18 o 19, donde el tampón es tampón borato.

21. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, donde el dendrímero tiene una concentración de entre 0, 01 y 0, 5 % (m/v) con respecto al tampón.

22. Uso del kit descrito en las reivindicaciones 18 a 21, para la separación de proteínas. 5

23. Uso del kit según la reivindicación anterior para la separación de proteínas vegetales.

24. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 22 o 23, para la obtención de perfiles proteicos. 10 25. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, para la caracterización de un alimento.

G0

FIG. 1 (CONT.)

G1

FIG. 1 (CONT.)

G2

FIG. 1

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5 101520 min

FIG. 2 FIG. 3 (CONT.)

min

FIG. 3

mUA

min FIG. 4