Un gen de fusión de NS3/4A no estructural optimizado por codón del virus de la hepatitis C.

Un ácido nucleico purificado o aislado que comprende al menos 200 nucleótidos consecutivos del gen de NS3/4A de SEC ID Nº 35 o su complementario,

en el que dicho ácido nucleico es capaz de inducir una respuesta inmunitaria contra NS3/4A de VHC.

Un gen de fusión de NS3/4A no estructural optimizado por codón del virus de la hepatitis C

Campo de la invención Aspectos de la presente invención se refieren a la creación de un nuevo gen de NS3/4A del virus de la hepatitis C (VHC) que se ha optimizado por codón para la expresión en seres humanos. Las realizaciones incluyen las composiciones de ácidos nucleicos de NS3/4A optimizados por codón que contienen dichos ácidos nucleicos así como procedimientos de fabricación y uso de las composiciones mencionadas anteriormente incluyendo, entre otros, diagnósticos o para preparar un medicamento para el tratamiento y prevención de la infección por VHC.

Antecedentes de la invención Los virus son parásitos intracelulares que requieren la maquinaria bioquímica de una célula huésped para replicarse y propagarse. Todas las partículas víricas contienen alguna información genérica que codifica proteínas estructurales virales y enzimas. El material genérico puede ser ADN o ARN monocatenario o bicatenario. (Virology, Fields ed., tercera edición, Lippencott-Raven publishers, pág. 72-83 (1996) ) . El ácido nucleico viral está rodeado por una cubierta de proteínas que se denomina cápsida. (Id.) En algunos virus, la cápsida está rodeado por una capa adicional compuesta por una membrana lipídica, denominada cubierta. (Id. en 83-95) .

El ciclo de vida típico del virus comienza con la infección de una célula huésped a través de la unión de la partícula viral a un receptor de superficie celular y la internalización de la cápsida viral. (Id. en 103) . De acuerdo con esto, un abanico de huésped de virus se limita a las células que expresan un receptor de superficie celular adecuado. Una vez internalizada, la partícula de virus se desmonta y su ácido nucleico se transcribe, traduce o replica. (Id.) En este punto, el virus puede sufrir replicación lítica, en la que se forman nuevas partículas víricas y se liberan de la célula infectada. (Id. en 105-11) . El virus de la gripe es un ejemplo típico de un virus que sufre replicación lítica inmediatamente tras la infección de una célula huésped. (Id. en 1369-85) .

Como alternativa, un virus puede entrar en fase latente, lo que se denomina lisogenia, en la que el genoma se replica pero pocas proteínas virales, o ninguna, se expresan realmente y no se forman partículas virales. (Id. en 21929) . Los herpesvirus, tales como el virus de Epstein-Barr, son ejemplos típicos de virus que establecen infección latente en las células huésped. (Id. en 229-34) . Al final, para que el virus se disemine, debe salir de la lisogenia y entrar en la fase lítica. Las partículas virales que se liberan durante la fase lítica infectan otras células del mismo individuo o se pueden transmitir a otro individuo donde establecen una nueva infección.

Dado que el ciclo de vida del virus comprende una fase intracelular y una fase extracelular, los sistemas de defensa inmunológicos tanto humoral como celular son importantes para combatir las infecciones virales. (Id. en 467-73) . Los anticuerpos dirigidos contra proteínas virales pueden bloquear la interacción de las partículas del virus con su receptor celular o, por otro lado, interferir con la internalización o los procesos de liberación. (Id. en 471) . Un anticuerpo capaz de interferir en el ciclo de vida del virus se denomina anticuerpo neutralizante.

Durante la replicación intracelular se producen proteínas virales, que son extrañas para la célula huésped y algunas de estas proteínas son digeridas por proteasas celulares después de acoplarse a una molécula del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) presentada sobre la superficie de la célula infectada. (Id. en 350-58) . Por tanto, la célula infectada se reconoce por los linfocitos T, los macrófagos o las células NK y se mata antes de que el virus se replique y se disemine a las células adyacentes. ( (Id. en 468-70) . Además, la presencia de los ácidos nucleicos virales, lo más notablemente en forma de ARN bicatenario, desencadena que la célula infectada apague su maquinaria de traducción y produzca moléculas de señalización antivirales conocidas como interferones. (Id. en 37679) .

No obstante, los virus han desarrollado varios medios de evitar el sistema de defensa inmunológico del huésped. Estableciendo latencia (es decir, lisogenia) , por ejemplo, el virus no entra en la fase lítica y evita el sistema de defensa inmunológico humoral. (Id. en 224) . Durante la fase de latencia, se producen pocas proteínas virales y las células infectadas tienen únicamente una mínima capacidad para presentar a los linfocitos y macrófagos que los rodean signos de que están en su estado infectado. (Id. en 225-26) . Adicionalmente, algunas proteínas virales, más especialmente las producidas durante la latencia, desarrollan secuencias polipeptídicas que no se pueden presentar de forma eficiente al sistema de defensa inmunológico mediado por células. (Levitskaya y cols., Nature 375: 685-88 (1995) ) . Por último, algunos virus puede interferir de forma activa en la respuesta inmunológica del huésped infectado, por ejemplo evitando la expresión en la superficie de moléculas del MHC (Fruh y cols., J. Mol. Med. 75: 18-27 (1997) ) , o alterando la señalización del interferón (Fortunato y cols., Trends Microbiol. 8: 111-19 (2000) ) .

Particularmente evasivos son los virus de la hepatitis, que no se clasifican como familia pero que se agrupan en base a su capacidad para infectar las células del hígado. El virus de la hepatitis C (VHC) pertenece a la familia Flaviviridae de virus con ARN monocatenario. Virology supra., pág. 945-51) . El genoma del VHC tiene una longitud de aproximadamente 9, 6 kb y codifica al menos diez polipéptidos. (Kato, Microb. Comp. Genomics, 5: 129-151 (2000) ) . El ARN genómico se traduce en una sola poliproteína que después se escinde mediante proteasas virales y celulares para dar los polipéptidos funcionales. (Id.) La poliproteína se escinde en tres proteínas estructurales (proteína del núcleo E1 y E2) , en p7 de función desconocida y en seis proteínas no estructurales (NS) (NS2, NS3, NS4A/B, NSSA/B) . (Id.) NS3 codifica una serín proteasa que es responsable de los acontecimientos proteolíticos requeridos para la maduración del virus (Kwong y cols., Antiviral Res., 41: 67-84 (1999) ) y NS4A actúa como cofactor para la proteasa NS3. (Id.) NS3 también exhibe actividad NTPasa y posee actividad ARN helicasa in vitro. (Kwong y cols., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 242: 171-96 (2000) ) .

La infección por VHC normalmente progresa desde una fase aguda a una crónica. (Virology, supra, páginas 104147) . La infección aguda se caracteriza por una elevada replicación viral y una carga viral alta en el tejido hepático y en sangre periférica. (Id. en 1041-42.) La infección aguda se elimina por el sistema de defensa inmunológica del paciente en aproximadamente el 15 % de los individuos infectados; en el otro 85 %, el virus establece una infección persistente crónica. (Lawrence, Adv. Intern. Med., 45: 65-105 (2000) ) . Durante la fase crónica se produce replicación en el hígado y algunos virus se pueden detectar en sangre periférica. (Virology, supra, páginas 1042) .

Es esencial para el establecimiento de una infección persistente el desarrollo de estrategias para evadir el sistema de defensa inmunológica del huésped. El VHC, como virus de ADN monocatenario, exhibe una elevada tasa de mutaciones en la replicación y transcripción de su genoma. (Id. en 1046) . Por tanto, se ha observado que los anticuerpos producidos durante la fase lítica apenas neutralizan las cepas de virus producidas durante la infección crónica. (Id.) Aunque parece que el VHC no interfiere con el procesamiento del antígeno y su presentación sobre moléculas del MHC-I, la proteína viral NS5A puede estar implicada en la represión de la señalización por interferón a través de la inhibición de la proteína cinasa PKR. (Tan y cols., Virology, 284: 1-12 (2001) ) .

El huésped infectado genera una respuesta inmunitaria humoral y celular contra el virus del VHC pero en la mayoría de los casos la respuesta no impide el establecimiento de la enfermedad crónica. Tras la fase aguda, el paciente infectado produce anticuerpos antivirales, incluyendo anticuerpos neutralizantes frente a las proteínas de la cubierta E1 y E2. (Id. en 1045) . Esta respuesta de anticuerpos se prolonga durante la infección crónica. (Id.) En pacientes infectados de forma crónica, el hígado también está infiltrado por linfocitos CD8+ y CD4+. (Id. en 1044-45) . Adicionalmente, los pacientes infectados producen interferones como una respuesta precoz a la infección viral. (Id. en 1045) . Es probable que la energía de la respuesta inmunológica... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico purificado o aislado que comprende al menos 200 nucleótidos consecutivos del gen de NS3/4A de SEC ID Nº 35 o su complementario, en el que dicho ácido nucleico es capaz de inducir una respuesta inmunitaria contra NS3/4A de VHC.

2. Un ácido nucleico purificado o aislado que comprende al menos 50 nucleótidos consecutivos del gen de NS3/4A de SEC ID Nº 35 o su complementario, en el que dicho ácido nucleico es capaz de inducir una respuesta inmunitaria contra NS3/4A de VHC y con la condición de que dicho ácido nucleico no tenga la secuencia establecida en las SEC ID Nº 3, 10 o 11 divulgada en el documento WO 03/031588 o la secuencia establecida en la SEC ID Nº 21 divulgada en el documento WO 2004/046175.

3. El ácido nucleico purificado o aislado de la reivindicación 2, en el que dicho ácido nucleico comprende al menos 60 nucleótidos consecutivos del gen de NS3/4A de SEC ID Nº 35 o su complementario.

4. El ácido nucleico purificado o aislado de la reivindicación 2, en el que dicho ácido nucleico comprende al menos 100 nucleótidos consecutivos del gen de NS3/4A de SEC ID Nº 35 o su complementario.

5. El ácido nucleico purificado o aislado de la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico comprende al menos 500 nucleótidos consecutivos del gen de NS3/4A de SEC ID Nº 35 o su complementario.

6. El ácido nucleico purificado o aislado de la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico comprende un gen de NS3/4A de SEC ID Nº 35 o su complementario.

7. El ácido nucleico purificado o aislado de la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico consiste en el gen de NS3/4A de SEC ID Nº 35 o su complementario.

8. Un vector que comprende el ácido nucleico purificado o aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Una composición inmunogénica que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

10. La composición inmunogénica de la reivindicación 9, que además comprende un adyuvante.

11. La composición inmunogénica de la reivindicación 9, que además comprende ribavirina.

12. Una célula aislada que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

13. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, el vector de la reivindicación 8, la composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 o la célula aislada de la reivindicación 12 para usar como un medicamento.

14. El uso del ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, el vector de la reivindicación 8, la célula aislada de la reivindicación 12, o la composición inmunogénica de las reivindicaciones 9-11 para preparar un medicamento con la finalidad de generar una respuesta inmunitaria a NS3/4A del VHC.

15. El uso del ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, el vector de la reivindicación 8, la célula aislada de la reivindicación 12, o la composición inmunogénica de las reivindicaciones 9-11 para preparar un medicamento con la finalidad de tratamiento o prevención de infección con VHC.

16. El uso del ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, el vector de la reivindicación 8, o la composición inmunogénica de las reivindicaciones 9-10 para la preparación de un medicamento para el tratamiento

o la prevención de la infección por VHC, en el que dicho medicamento es para administrar solo o junto con una ribavirina, que se puede administrar por separado en lugar de en una mezcla única.

17. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 o 16, en el que dicho medicamento es para el tratamiento del carcinoma hepatocelular (CHC) o una infección por VHC de fase crónica o aguda.

18. El procedimiento para fabricar un inmunógeno que comprende:

proporcionar ribavirina proporcionar un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o el vector de la reivindicación 8;

combinar dicha ribavirina y dicho ácido nucleico o dicho vector de forma que se formule dicho inmunógeno.

19. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o el uso de las reivindicaciones 14 o 15, en la que dicho ácido nucleico se formula para administrar mediante vía transdérmica, intradérmica, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o vía inhalación.

20. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o el uso de las reivindicaciones 14 o 15, en la que dicho ácido nucleico se formula para administrar mediante electroporación, bombardeo de micropartículas o inyección sin aguja.