Un complejo insulinotrópico utilizando un fragmento de inmunoglobulina.

Un conjugado de péptido insulinotrópico que comprende un péptido insulinotrópico y una región Fc deinmunoglobulina,

que están enlazados por medio de un polímero no peptídico, en donde el péptido insulinotrópico seselecciona del grupo que consiste de una exendina-4, des-amino-histidil exandina-4, beta-hidroxi-imidazo-propionilexendina-4, dimetil-histidil exendina-4, o imidazo-acetil exendina-5 4, en donde el polímero no peptídico se seleccionadel grupo que consiste de polietilén glicol, polipropilén glicol, copolímeros de etilenglicol y propilén glicol, poliolespolioxietilados, alcohol polivinílico, polisacáridos, dextrano, éter polivinil-etílico, polímeros biodegradables, polímerosIipídicos, quitinas, ácido hialurónico, y combinaciones de los mismos, y en donde un extremo del polímero nopeptídico se enlaza a un residuo de amino ácido diferente del terminal N del péptido insulinotrópico.

Un complejo insulinotrópico utilizando un fragmento de inmunoglobulina Campo de la invención La presente invención se refiere a un conjugado de un péptido insulinotrópico para una formulación de acción prolongada de un péptido insulinotrópico. Específicamente, la presente invención se refiere a un conjugado de un péptido insulinotrópico modificado que tiene una duración de eficacia in vivo notablemente mejorada, generada enlazando covalentemente el péptido insulinotrópico con un polímero no peptídico y una inmunoglobulina Fc, y un método para la preparación del mismo Antecedentes de la invención Los péptidos tienden a ser fácilmente desnaturalizados debido a su baja estabilidad, degradados por enzimas proteolíticas in vivo, perdiendo así la actividad, y tienen un tamaño relativamente pequeño, pasando así fácilmente a través del riñón. Por consiguiente, con el propósito de mantener los niveles en sangre y los títulos de un medicamento que comprende un péptido como componente farmacéuticamente efectivo, es necesario administrar frecuentemente el fármaco peptídico a un paciente para mantener los niveles y los títulos deseados en sangre. Sin embargo, los fármacos peptídicos usualmente se administran en forma de preparaciones inyectables y su administración frecuente ocasiona dolor severo a los pacientes. Para resolver estos problemas, se han hecho muchos esfuerzos. En uno de tales esfuerzos, se ha intentado transferir el fármaco peptídico por medio de inhalación orofaríngea o nasofaríngea, aumentando la trasmisión del fármaco peptídico a través de las membranas biológicas. Sin embargo, con este enfoque todavía es difícil mantener la actividad in vivo del fármaco peptídico debido a la baja eficiencia de la transferencia in vivo, en comparación con la inyección.

Por otra parte, se han hecho muchos esfuerzos para mejorar la estabilidad del fármaco peptídico en la sangre, y para mantener el fármaco en la sangre en un nivel alto durante un periodo prolongado de tiempo, maximizando así la eficacia farmacéutica del fármaco. La preparación de acción prolongada de tal fármaco peptídico requiere por lo tanto aumentar la estabilidad del fármaco peptídico y mantener los títulos a niveles sufcientemente altos sin ocasionar respuestas inmunes en los pacientes.

Como un método para estabilizar el péptido, e inhibir la degradación por una enzima proteolítica, se han hecho algunas pruebas para modificar una secuencia específica de aminoácidos que es sensible a la enzima proteolítica. Por ejemplo, GLP-1 (amida 7 -37 o 7 -36) , que funciona para reducir la concentración de glucosa en Ia sangre para tratar una diabetes tipo 2, tiene una vida media corta de la actividad fisiológica de aproximadamente 4 minutos, o menos (Kreymann et al., 1987) , debido a la pérdida de los títulos del GLP-1 por el corte entre el 8° aminoácido (Ala) y el 9° aminoácido (Asp) causado por una dipeptidil peptidasa IV (DPP IV) . Como resultado, se han hecho varias investigaciones sobre un análogo de GLP-1 que tenga resistencia a DPP IV, y se han hecho pruebas para la sustitución de Ala8 con Gly (Deacon et al., 1998; Burcelin et al., 1999) , o con Leu o D-AIa (Xiao et al., 2001) , aumentando así la resistencia a DPP IV, pero manteniendo la actividad. EI aminoácido del terminal N, His7 de GLP-T, es crítico, para Ia actividad de GLP-1 y sirve como un objetivo de DPP IV. Por consiguiente, la patente de EE. UU.. No. 5.545.618 describe que el terminal N se modifica con un grupo alquilo o acilo, y Gallwitz et al. describen que la 7a His fue sometida a metilación en N, o metiIación en alfa, o se sustituyó toda la His con imidazol para incrementar la resistencia a DPP IV, y para mantener Ia actividad fisiológica.

Además de estas modificaciones, un exendina-4, que es un análogo de GLP-1 purificado de la glándula salival del monstruo de Gila (patente de EE. UU.. No. 5.424.686) , tiene resistencia a DPP IV, y una actividad fisiológica más alta que GLP-1. Como resultado, tenía una vida media in vivo de 2 a 4 horas, que era más larga que aquella de GLP-1. Sin embargo, con el método para aumentar la resistencia a DPP IV únicamente, la actividad fisiológica no es suficientemente sostenida y, por ejemplo, en el caso de un exendina-4 comercialmente disponible (exenatida) , se requiere inyectar a un paciente dos veces al día, que todavía es difícil para los pacientes.

Estos péptidos insulinotrópicos tienen un problema, usualmente porque el tamaño del péptido es pequeño. De esta manera, no pueden ser recuperados en el riñón, y entonces son descargados fuera del organismo. Por consiguiente, se ha usado un método para añadir químicamente una sustancia polimérica que tiene alta solubilidad, tal como polietilén glicol (PEG) , sobre la superficie del péptido para inhibir la pérdida en el riñón.

El PEG no se enlaza específicamente a un sitio específico o a diferentes sitios de un péptido objetivo para producir el efecto de incrementar el peso molecular de un péptido, y de esta manera inhibir la pérdida en el riñón, y prevenir la hidrólisis, sin ocasionar ningún efecto secundario. Por ejemplo, la publicación internacional de patente WO 2006/076471 describe que PEG enlaza a un péptido natriurético de tipo B, o BNP, que se enlaza con NPR-A para activar la producción de GMPc, que conduce a una reducción de la presión sanguínea arterial, y como resultado, se usa como un agente terapéutico para la insuficiencia cardiaca congestiva, manteniendo así la actividad fisiológica. La patente de EE. UU.. No. 6.924.264 describe que PEG se enlaza al residuo de lisina de una exendina-4 para aumentar su tiempo de residencia in vivo. Sin embargo, este método aumenta el peso molecular del PEG, aumentando así el tiempo de residencia in vivo del fármaco peptídico, pero conforme aumenta el peso molecular, el título del fármaco peptídico se reduce notablemente y la reactividad con el péptido también se reduce. Por consiguiente, reduce indeseablemente el rendimiento.

La publicación internacional de patente No. WO 02/46227 describe una proteína de fusión preparada acoplando GLP-1, una exendina-4, o un análogo de los mismos con albúmina de suero humano o una región de inmunoglobulina (Fc) , usando tecnología de recombinación genética. La patente de EE. UU.. No. 6.756.480 describe una proteína de fusión de Fc preparada acoplando una hormona paratiroidea (PTH) y un análogo de la misma con Ia región Fc. Estos métodos pueden manejar problemas tales como bajo rendimiento de pegilación y falta de especifcidad, pero todavía tienen el problema de que el efecto del aumento de la vida media en la sangre no es como se esperaba, y algunas veces los títulos también son bajos. Para maximizar el efecto del aumento de la vida media en la sangre, se usan varios tipos de enlazadores de péptido, pero posiblemente pueden causar una respuesta inmune. Además, si se utiliza un péptido que tiene enlaces disulfuro, tal como BNP, existe una alta probabilidad de plegamiento erróneo. Como resultado, difícilmente se puede usar dicho péptido.

Además, un derivado de GLP-1, NN2211, se prepara por sustitución del aminoácido de GLP-1, y se enlaza a una cadena lateral acilo para formar un enlace no covalente con albúmina, aumentando así su tiempo de residencia in vivo. Sin embargo, tienen una vida media de 11 a 15 horas, lo que no indica un aumento notable en la vida media, en comparación con la exendina-4. De esta manera, el derivado de GLP-1 todavía requiere ser inyectado una vez al día (Nauck et al., 2004) . Además, CJC-1131 es un derivado de GLP-1 que tiene un grupo reactivo de maleimida para enlazar covalentemente al GLP-1 con albúmina en la sangre, y se han hecho esfuerzos por desarrollar el CJC1131 con la finalidad de aumentar la vida media in vivo, pero tales esfuerzos se detuvieron ahora. Una sustancia sugerida posteriormente, CJC-1134, es una exendina-4 que se enlaza covalentemente a una albúmina recombinante, y no exhibió un efecto notable de aumentar la estabilidad en la sangre, siendo la vida media en la sangre de aproximadamente 17 horas (en Rata) (Thibauoleau et al., 2006) .

Divulgación de la invención Problema técnico En consecuencia, los presentes inventores enlazaron una inmunoglobulina Fc y un polímero no peptídico a un péptido insulinotrópico, específicamente en el sitio en un residuo de aminoácido diferente al terminal N por medio de un enlace covalente, y se encontró que el conjugado de la presente invención ejerce una eficacia in vivo y una vida media notablemente mejoradas. Especialmente, encontraron que, entre los conjugados de péptidos insulinotrópicos, los conjugados de péptidos tales como Exendina-4, des-amino-histidil exendina-4, en donde el grupo amino del terminal... [Seguir leyendo]

1. Un conjugado de péptido insulinotrópico que comprende un péptido insulinotrópico y una región Fc de inmunoglobulina, que están enlazados por medio de un polímero no peptídico, en donde el péptido insulinotrópico se

selecciona del grupo que consiste de una exendina-4, des-amino-histidil exandina-4, beta-hidroxi-imidazo-propionil exendina-4, dimetil-histidil exendina-4, o imidazo-acetil exendina-4, en donde el polímero no peptídico se selecciona del grupo que consiste de polietilén glicol, polipropilén glicol, copolímeros de etilenglicol y propilén glicol, polioles polioxietilados, alcohol polivinílico, polisacáridos, dextrano, éter polivinil-etílico, polímeros biodegradables, polímeros Iipídicos, quitinas, ácido hialurónico, y combinaciones de los mismos, y en donde un extremo del polímero no peptídico se enlaza a un residuo de amino ácido diferente del terminal N del péptido insulinotrópico.

2. El conjugado de péptido insulinotrópico de conformidad con la reivindicación 1, en donde el derivado insulinotrópico está representado por la siguiente Fórmula Química 1: R1-X-Y-Z-R2 <Fórmula 1>

en donde R1 se selecciona del grupo que consiste de histidina, del grupo des-amino-histidilo, el grupo N-dimetil-histidilo, el grupo beta-hidroxi imidazo-propilo y el grupo 4-imidazoacetilo;

R2 se selecciona del grupo que consiste de -NH2, -OH y -Lys;

X se selecciona del grupo que consiste de Gly-Glu-GIy-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-R3-Gln-Met-GIu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-R4-Asn-

Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-A|a-Pro-Pro-Pro-Ser, y GIy-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-R3-Gln-Met-Glu-GIu-GIu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-lle-GIu-Trp-Leu-R4-Asn-Gly-Gly; R3 se selecciona del grupo que consiste de Lys, Ser y Arg; R4 se selecciona del grupo que consiste de Lys, Ser y Arg; Y es polietilén glicol, polipropilén glicol, copolímeros de etilén glicol y propilén glicol, polioles polioxietilados, alcohol

polivinílico, polisacáridos, dextrano, éter polivinil-etílico, polímeros biodegradables, polímeros lipídicos, quitinas, ácido hialurónico, y combinaciones de los mismos; y Z es una región Fc de inmunoglobulina

3. El conjugado de péptido insulinotrópico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polímero no peptídico tiene ambos extremos, cada uno enlazando a un grupo amino o un grupo tiol de la región Fc de inmunoglobulina, y al péptido insulinotrópico

4. El conjugado de péptido insulinotrópico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la región Fc de inmunoglobulina está desglicosilada.

5. El conjugado de péptido insulinotrópico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la región Fc de inmunoglobulina está compuesta de uno a cuatro dominios seleccionados del grupo que consiste de los dominios CH1, CH2, CH3 y CH4.

6. El conjugado de péptido insulinotrópico de acuerdo con la reivindicación 5, en donde Ia región Fc de inmunoglobulina incluye además una región de bisagra.

7. El conjugado de péptido insulinotrópico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde Ia región Fc de inmunoglobulina es una región Fc derivada de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste de lgG, lgA, lgD, IgE e IgM.

8. El conjugado de péptido insulinotrópico de acuerdo con la reivindicación 7, en donde cada dominio de la región Fc de inmunoglobulina es un híbrido del dominio de un origen diferente derivado de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste de lgG, IgA, IgD, IgE e IgM.

9. El conjugado de péptido insulinotrópico de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la región Fc de inmunoglobulina es un dímero o un multímero (una combinación de inmunoglobulina Fc) compuesto de inmunoglobulinas de una sola cadena del mismo origen.

10. El conjugado de péptido insulinotrópico de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la región Fc de inmunoglobulina es una región Fc de lgG4.

11. El conjugado de péptido insulinotrópico de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la región Fc de inmunoglobulina es una región Fc de IgG4 desglicosilada humana.

12. El conjugado de péptido insulinotrópico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el grupo reactivo del polímero no peptídico se selecciona del grupo que consiste de un grupo aldehído, un grupo propionaldehído, un grupo butiraldehído, un grupo maleimido, y un derivado de succinimida.

13. El conjugado de péptido insulinotrópico de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el derivado de succinimida

se selecciona del grupo que consiste de propionato de succinimidilo, succinimidilcarboximetilo, hidroxi succinimidilo,

o carbonato de succinimidilo.

14. El conjugado de péptido insulinotrópico de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el polímero no peptídico tiene un grupo aldehído reactivo en ambos extremos.

15. El conjugado de péptido insulinotrópico de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el polímero no peptídico es polietilén glicol.

16. Un método para preparar un conjugado de péptido insulinotrópico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

(1) enlazar covalentemente un polímero no peptídico que tiene un grupo reactivo seleccionado del grupo que consiste de derivados de aldehído, de maleimida, y de succinimida en ambos extremos del mismo, con un grupo amino o un grupo tioI de un péptido insulinotrópico seleccionado del grupo que consiste de una exendina-4, desamino-histidil exandina-4, beta-hidroxi-imidazo-propionil exendina-4, dimetil-histidil exendina-4, o imidazo-acetil exendina-4;

(2) aislar un conjugado que comprende al péptido insulinotrópico de la mezcla de reacción de (1) , en donde el polímero no peptídico está enlazado covalentemente a un amino ácido diferente al amino ácido en el terminal N; y

(3) enlazar covalentemente una región Fc de inmunoglobulina con el otro extremo del polímero no peptídico del conjugado aislado, para producir un conjugado peptídico que comprende la región Fc de inmunoglobulina y el péptido insulinotrópico, que están enlazados a cada extremo del polímero no peptídico.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende las etapas de:

(1) enlazar covalentemente un polímero no peptídico que tiene un grupo aldehído reactivo en ambos extremos del mismo, con el residuo de lisina de un péptido insulinotrópico seleccionado del grupo que consiste de una exendina4, des-amino-histidil exandina-4, beta-hidroxi-imidazo-propionil exendina-4, dimetil-histidil exendina-4, o imidazoacetil exendina-4, a pH de 7, 5 o más;

(2) aislar un conjugado que comprende al péptido insulinotrópico de la mezcla de reacción de (1) , en el cual el polímero no peptídico está enlazado covalentemente al residuo de lisina; y

(3) enlazar covalentemente una región Fc de inmunoglobulina con el otro extremo del polímero no peptídico del conjugado aislado, para producir un conjugado de proteína que comprende la región Fc de inmunoglobulina y el péptido insulinotrópico, que están enlazados a cada extremo del polímero no peptídico. Más preferiblemente, el polímero no peptídico de (1) y el residuo de lisina del péptido insulinotrópico se enlazan a un pH 7, 5 o superior.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, en donde el péptido insulinotrópico es des-amino-histidil exendina-4.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, en donde el péptido insulinotrópico es beta-hidroxi-imidazopropionil exendina-4.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, en donde el péptido insulinotrópico es imidazo-acetil exendina-4.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, en donde el péptido insulinotrópico es dimetil-histidil exendina-4.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, en donde el polímero no peptídico es propilén glicol.

23. Una composición farmacéutica, que comprende el conjugado de péptido insulinotrópico de la reivindicación 1 para uso en el tratamiento de la diabetes, obesidad, síndrome coronario agudo, o síndrome de ovario poliquístico.