Transportadores mejorados y sus usos.

Un método para aumentar la tolerancia a la sal en una planta, y el método comprende,

a.

introducir en la planta un polinucleótido que codifica un polipéptido transportador Na+/H+ truncado en elextremo C-terminal, que cuando se expresa confiere una tolerancia incrementada a la sal en la planta; y en elque el polipéptido transportador truncado consiste en una secuencia de aminoácidos que es:

i. al menos un 80% idéntica a SEQ ID Nº:2 a lo largo de toda la longitud del polipéptido transportadortruncado; y

ii. menor de una longitud de 475 aminoácidos; y

b. seleccionar una planta que exhibe una tolerancia incrementada a la sal en comparación con una planta enla que se ha introducido un polipéptido que codifica un péptido de SEQ ID Nº:2.

Transportadores mejorados y sus usos Campo de la Invención La presente invención está relacionada en general con la ingeniería genética de plantas. En particular, la invención se dirige a ácidos nucleicos y métodos para conferir tolerancia a la sal en plantas y otros organismos.

Antecedentes de la Invención

El estrés ambiental debido a la salinidad es uno de los factores más importantes que limitan la productividad de las cosechas agrícolas, que son sensibles de manera predominante a la presencia de concentraciones elevadas de sales en la tierra. Grandes áreas terrestres del mundo están afectadas por niveles de sal perjudiciales para el cultivo de plantas. Se estima que un 35-45% de los 279 millones de hectáreas de terreno de regadío está afectado actualmente por la salinidad. Esto es exclusivo de las regiones clasificadas como terrenos áridos y desérticos (que constituyen un 25% del terreno total de nuestro planeta) . La salinidad ha sido un factor importante en la historia humana y en la duración de los sistemas agrícolas. La incidencia de la sal en las tierras agrícolas ha creado inestabilidad, y con frecuencia ha destruido sociedades agrícolas antiguas y recientes. El poder de la cultura sumeria decayó en el mundo antiguo debido a la acumulación de sal en los valles de los ríos Eufrates y Tigris. Grandes áreas del subcontinente indio se han vuelto improductivas debido a la acumulación de sal y a prácticas de irrigación de mala calidad. En este siglo, otras áreas, que incluyen extensas regiones de Australia, Europa, suroeste de los EE.UU., las llanuras canadienses y otras, han visto descensos considerables de la productividad de los cultivos.

Aunque hay disponibles técnicas de ingeniería para combatir este problema, por medio del drenaje y el aporte de agua de alta calidad, estas medidas son extremadamente costosas. En la mayoría de los casos, debido a la necesidad creciente de agricultura extensiva, no es aplicable ni una eficacia de irrigación mejorada ni la instalación de sistemas de drenaje. Además, en las regiones áridas y semiáridas del mundo, la evaporación de agua supera a la precipitación. Estas tierras tienen un contenido de sal intrínsecamente elevado, y requieren grandes cantidades de irrigación para hacerse productivas. Debido a que el agua de irrigación contiene sales y minerales disueltos, la aplicación de agua es también la aplicación de la sal, que agrava el problema de la salinidad.

Se está poniendo cada vez más énfasis en la modificación de plantas para adaptarse a las condiciones de cultivo restrictivas impuestas por la salinidad. Si las cosechas económicamente importantes se pudieran manipular y hacer resistentes a la sal, este terreno se podría cultivar, lo que daría como resultado mayores ventas de semillas y mayor producción de cultivos útiles. Se ha intentado la mejora genética convencional con respecto a la tolerancia a la sal durante mucho tiempo. Estas prácticas de mejora genética se han basado principalmente en las siguientes estrategias: a) el uso de cruces amplios entre plantas de cultivo y sus parientes salvajes más tolerantes a la sal (Rush y Epstein, J. Amer. Hort. Sci., 106: 699-704 (1981) ) , b) cribando y seleccionando en función de una variación dentro de un fenotipo particular (Norlyn, en Genetic Engineering of Osmoregulation, págs. 293-309 (1980) ) , c) diseñando fenotipos nuevos por medio de la selección recurrente (Tal, Plant & Soil, 89: 199-226 (1985) ) . El fracaso en la generación de variedades tolerantes (dado el número bajo de variedades comercializadas y su tolerancia limitada a la sal) (Flowers y Yeo, Aust. J. Plant. Physiol., 22: 875-884 (1995) ) indicaría que las prácticas de mejora genética convencionales no son suficientes, y que para tener éxito un programa de mejora genética debería incluir la modificación de cultivos transgénicos (Bonhert y Jensen, Aust. J. Plant. Physiol., 23: 661-667 (1996) ) .

Se han caracterizado varias rutas bioquímicas asociadas a la tolerancia al estrés en diferentes plantas, y se han identificado algunos de estos genes implicados en estos procesos, y en ciertos casos se ha investigado el posible papel de las proteínas en experimentos transgénicos/de sobreexpresión. Se ha propuesto que varios solutos compatibles desempeñan un papel en la osmorregulación bajo estrés. Se ha demostrado que tales solutos compatibles, que incluyen los carbohidratos (Tarcynski et al., Science, 259: 508-510 (1995) ) , aminoácidos (Kishor et al., Plant Physiol., 108: 1387-1394 (1995) ) y compuestos de N cuaternario (Ishtani et al., Plant Mol. Biol., 27: 307- 317 (1995) ) incrementan la osmorregulación bajo estrés. Además, se ha propuesto que las proteínas que se expresan normalmente durante la maduración de las semillas (LEAs, proteínas abundantes en la embriogénesis tardía) desempeñan un papel en la retención de agua y en la protección de otras proteínas durante el estrés. La sobreexpresión de LEA en arroz proporcionó un beneficio moderado a las plantas durante el estrés hídrico (Xu et al., Plant Physiol, 110: 249257 (1996) , y Wu y Ho, documento WO 97/13843) .

Se ha demostrado que un único gen (sod2) que codifica un antiportador Na+/H+ confiere tolerancia al sodio en la levadura de fisión (Jia et al., EMBO J., 11: 1631-1640 (1992) y Young y Zheng, documento WO 91/06651) , aunque el papel de esta proteína asociada a la membrana plasmática parece limitarse solamente a la levadura. Una de las desventajas principales de usar este gen para la transformación de plantas está asociada a los problemas típicos que se encuentran en la expresión de genes heterólogos, es decir, el plegamiento incorrecto del producto del gen, el transporte de la proteína a la membrana de interés y la regulación de la función de la proteína.

Se han identificado antiportadores Na+/H+ con actividad antiportadora vacuolar en tejido de almacenamiento de remolacha roja y una diversidad de especies de plantas halofíticas y glicofíticas tolerantes a la sal (Barkla y Pantoja, Ann. Rev. Plant. Physiol. 47: 159 (1996) , y Blumwald y Gelli, Adv. Bot. Res. 25: 401 (1997) ) . Más recientemente, se ha aislado un gen que codifica un antiportador Na+/H+ vacuolar de Arabidopsis thaliana, denominado AtNHX1 (Blumwald et al., documento WO 99/47679) . Se ha demostrado que la sobreexpresión de este gen en Arabidopsis, tomate, y colza aumenta la tolerancia a la sal en las plantas transgénicas (Apse et al., Science, 285: 1256-1258 (1999) , Zhang y Blumwald, Nat. Biotechnol., 19: 765-768 (2001) , y Zhang et al., PNAS USA, 98: 12832-12836 (2001) ) .

El documento WO99/47679 describe moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos intercambiadores Na+/H+ para la expulsión de cationes monovalentes desde el citosol de células con tolerancia incrementada a la sal. Los ácidos nucleicos se obtienen de Arabidopsis thaliana.

Breve Compendio de la Invención La presente invención proporciona un método para aumentar la tolerancia a la sal en una planta, y el método comprende, a) introducir en la planta un polinucleótido que codifica un polipéptido transportador Na+/H+ truncado en el extremo C-terminal, que cuando se expresa confiere una tolerancia incrementada a la sal en la planta; y en el que el polipéptido transportador truncado consiste en una secuencia de aminoácidos que es: i) al menos un 80% idéntica a SEQ ID Nº:2 a lo largo de toda la longitud del polipéptido transportador truncado; y ii) menor de una longitud de 475 aminoácidos; y b) seleccionar una planta que exhibe una tolerancia incrementada a la sal en comparación con una planta en la que se ha introducido un polipéptido que codifica un péptido de SEQ ID Nº:2. En ciertos aspectos, la presente invención proporciona un método para aumentar la tolerancia a la sal de una planta, y el método comprende, a) introducir en la planta un polinucleótido que codifica un polipéptido transportador Na+/H+, que cuando se expresa confiere una tolerancia incrementada a la sal en la planta; y en el que el polipéptido transportador comprende: i) una secuencia de aminoácidos al menos un 80% idéntica a SEQ ID Nº:2 a lo largo de toda la longitud del polipéptido transportador; y ii) en el que el residuo correspondiente a la serina de la posición 508 en SEQ ID Nº:2 se sustituye por un aminoácido que confiere la tolerancia incrementada a la sal del polipéptido transportador Na+/H+; y b) seleccionar una planta con una tolerancia aumentada a la sal en comparación con una planta en la que se ha introducido un polipéptido que codifica un péptido de SEQ ID Nº:2.

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona un vector de ADN recombinante adecuado para transformar células vegetales que comprende un promotor y una secuencia polinucleotídica... [Seguir leyendo]

1. Un método para aumentar la tolerancia a la sal en una planta, y el método comprende,

a. introducir en la planta un polinucleótido que codifica un polipéptido transportador Na+/H+ truncado en el extremo C-terminal, que cuando se expresa confiere una tolerancia incrementada a la sal en la planta; y en el que el polipéptido transportador truncado consiste en una secuencia de aminoácidos que es:

i. al menos un 80% idéntica a SEQ ID Nº:2 a lo largo de toda la longitud del polipéptido transportador truncado; y

ii. menor de una longitud de 475 aminoácidos; y

b. seleccionar una planta que exhibe una tolerancia incrementada a la sal en comparación con una planta en la que se ha introducido un polipéptido que codifica un péptido de SEQ ID Nº:2.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el polipéptido transportador está truncado en el extremo C-terminal mediante la deleción de 84 aminoácidos del extremo C-terminal.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido es SEQ ID Nº: 9 y/o codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID Nº: 10.

4. Un método para aumentar la tolerancia a la sal de una planta, y el método comprende,

a. introducir en la planta un polinucleótido que codifica un polipéptido transportador Na+/H+, que cuando se expresa confiere una tolerancia incrementada a la sal en la planta; y en el que el polipéptido transportador comprende:

i. una secuencia de aminoácidos al menos un 80% idéntica a SEQ ID Nº:2 a lo largo de toda la longitud del polipéptido transportador; y

ii. en el que el residuo correspondiente a la serina de la posición 508 en SEQ ID Nº:2 se sustituye por un aminoácido que confiere la tolerancia incrementada a la sal del polipéptido transportador Na+/H+; y

b. seleccionar una planta con una tolerancia aumentada a la sal en comparación con una planta en la que se ha introducido un polipéptido que codifica un péptido de SEQ ID Nº:2.

5. El método según la reivindicación 4, en el que el aminoácido que sustituye la serina de la posición 508 es un aminoácido polar neutro.

6. El método según la reivindicación 4, en el que el aminoácido que sustituye la serina de la posición 508 se selecciona del grupo que consiste en treonina, metionina, cisteína, asparagina y glutamina.

7. El método según la reivindicación 6, en el que el aminoácido que sustituye la serina de la posición 508 es cisteína.

8. Un vector de ADN recombinante adecuado para transformar células vegetales que comprende un promotor y una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido transportador Na+/H+ truncado en el extremo C-terminal que cuando se expresa confiere una tolerancia incrementada a la sal en una planta en comparación con una planta en la que se ha introducido un polipéptido que codifica un péptido de SEQ ID Nº:2; en el que el polipéptido transportador truncado consiste en una secuencia de aminoácidos que es:

i. al menos un 90% idéntica a SEQ ID Nº:2 a lo largo de toda la longitud del polipéptido transportador truncado; y

ii. menor de una longitud de 475 aminoácidos.

9. El vector de la reivindicación 8, en el que la secuencia nucleotídica es SEQ ID Nº:9 y/o codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº: 10.

10. Un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido transportador Na+/H+ que cuando se expresa confiere una tolerancia incrementada a la sal en una planta en comparación con una planta en la que se ha introducido un polipéptido que codifica un péptido de SEQ ID Nº:2, en el que el polipéptido transportador comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80% idéntica a SEQ ID Nº:2 a lo largo de toda la longitud del polipéptido transportador, en el que el residuo correspondiente a la serina de la posición 508 en SEQ ID Nº:2 se sustituye por un aminoácido que confiere la tolerancia incrementada a la sal.

11. El polinucleótido según la reivindicación 10, en el que el aminoácido que sustituye la serina de la posición 508 es un aminoácido polar neutro.

12. El polinucleótido según la reivindicación 10, en el que el aminoácido que sustituye la serina de la posición 508 se selecciona del grupo que consiste en treonina, metionina, cisteína, asparagina y glutamina.

13. El polinucleótido según la reivindicación 10, en el que el aminoácido que sustituye la serina de la posición 508 es cisteína.

14. El polinucleótido según la reivindicación 10, en el que la secuencia nucleotídica es SEQ ID Nº:3.

15. El polipéptido según la reivindicación 10, que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID Nº:4.

16. Una planta que comprende un polinucleótido seleccionado de (a) y (b) :

(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido transportador Na+/H+ truncado en el extremo C-terminal, que cuando se expresa confiere una tolerancia incrementada a la sal en la planta en comparación con una planta en la que se ha introducido un polipéptido que codifica un péptido de SEQ ID Nº:2; y en el que el polipéptido transportador truncado consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a SEQ ID Nº:2 a lo largo de toda la longitud del polipéptido transportador truncado, y en el que el polipéptido es menor de una longitud de 475 aminoácidos; y

(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido transportador Na+/H+ que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID Nº:6; SEQ ID Nº: 8; y SEQ ID Nº: 10.

17. La planta según la reivindicación 16, en la que el polinucleótido es SEQ ID Nº: 9 y/o codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID Nº: 10.

18. Una planta que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido transportador Na+/H+, que cuando se expresa confiere una tolerancia incrementada a la sal en la planta en comparación con una planta en la que se ha introducido un polipéptido que codifica un péptido de SEQ ID Nº:2; y en la que el polipéptido transportador comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80% idéntica a SEQ ID Nº:2 a lo largo de toda la longitud del polipéptido transportador; y

en la que el residuo correspondiente a la serina de la posición 508 en SEQ ID Nº:2 se sustituye por un aminoácido que confiere la tolerancia incrementada a la sal.

19. La planta según la reivindicación 18, en la que el aminoácido que sustituye la serina de la posición 508 es un aminoácido polar neutro.

20. La planta según la reivindicación 18, en la que el aminoácido que sustituye la serina de la posición 508 se selecciona del grupo que consiste en treonina, metionina, cisteína, asparagina y glutamina.

21. La planta según la reivindicación 18, en la que el aminoácido que sustituye la serina de la posición 508 es cisteína.

22. La planta según la reivindicación 18, en la que la secuencia nucleotídica es SEQ ID Nº:3 y/o el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID Nº:4.

23. El uso de un polinucleótido para aumentar la tolerancia a la sal en una planta, y el polinucleótido se selecciona de:

(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido transportador Na+/H+ truncado en el extremo C-terminal, que cuando se expresa confiere una tolerancia incrementada a la sal en la planta; y en el que el polipéptido transportador truncado consiste en una secuencia de aminoácidos que es:

i. al menos un 80% idéntica a SEQ ID Nº:2 a lo largo de toda la longitud del polipéptido transportador truncado; y

ii. el polipéptido transportador es menor de una longitud de 475 aminoácidos; y

en el que el polinucleótido se introduce en una planta, y se selecciona una planta que exhibe una tolerancia incrementada a la sal en comparación con una planta en la que se ha introducido un polipéptido que codifica un péptido de SEQ ID Nº:2; y

(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido transportador Na+/H+ que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

i) SEQ ID Nº:6;

ii) SEQ ID Nº: 8;y

iii) SEQ ID Nº: 10.

NaCl Higromicina

KCl 0 M KCl 0, 75 M KCl 1 M KCl 1, 25 M KCl 1, 5 M

Mutagénesis dirigida de AtNHX1

Unión

Unión de de H+?

Na+?

HÉLICE PRIMARIA HÉLICE SECUND.

POSIBLE TM

UNIÓN DECAM

Unión de Amilorida

DELECIÓN 1DELECIÓN 3 DELECIÓN 2