Transferencia y expresión de genes de alta eficacia en células de mamíferos por un método de transfección múltiple de secuencias de regiones de fijación a la matriz.

Una secuencia de DNA aislada y purificada que tiene una actividad que aumenta la producción de proteínas,

caracterizada por que dicha secuencia de DNA comprende a) al menos un elemento de DNA curvado, en donde elelemento de DNA curvado contiene al menos 33% del dinucleótido TA y/o al menos 33% del dinucleótido AT en untramo de 100 pares de bases contiguos, b) al menos un sitio de unión para una proteína de unión a DNA, y porquees una secuencia de nucleótidos de MAR que tiene la secuencia SEQ ID No 27, o una de sus secuenciascomplementarias, o una secuencia que tiene una identidad de al menos 90% con dicha secuencia SEQ ID No 27.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10178873.

Solicitante: SELEXIS S.A.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: 18, CHEMIN DES AULX 1228 PLAN-LES-OUATES SUIZA.

Inventor/es: Mermod,Nicolas, Girod,Pierre Alain, Bucher,Philipp, Nguyen,Duc-Quang, Calabrese,David, Saugy,Damien, Puttini,Stefania.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A01K67/027 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA.A01K CRÍA DE ANIMALES; AVICULTURA; APICULTURA; PISCICULTURA; PESCA; ANIMALES PARA CRIA O REPRODUCCIÓN, NO PREVISTOS EN OTRO LUGAR; NUEVAS VARIEDADES DE ANIMALES.A01K 67/00 Cría u obtención de animales, no prevista en otro lugar; Nuevas razas de animales. › Nuevas razas de vertebrados.
  • C12N15/10 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
  • C12N15/11 C12N 15/00 […] › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
  • C12N15/63 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.
  • C12N15/67 C12N 15/00 […] › Métodos generales para favorecer la expresión.
  • C12N15/79 C12N 15/00 […] › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a huéspedes eucariotas.

PDF original: ES-2400296_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Transferencia y expresión de genes de alta eficacia en células de mamíferos por un método de transfección múltiple de secuencias de regiones de fijación a la matriz.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a secuencias de DNA aisladas y purificadas que tienen una actividad que aumenta la producción de proteínas y más específicamente al uso de regiones de fijación a la matriz (abreviadamente en lo sucesivo MAR por la expresión inglesa Matrix Attachment Regions) para aumentar la actividad de producción de proteínas en una célula eucariótica. También se describe un método para la identificación de dichas regiones activas, en particular secuencias de nucleótidos de MAR y el uso de estas secuencias de MAR activas caracterizadas en un nuevo método de transfección múltiple.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Actualmente, el modelo de organización de dominios en bucle de cromosomas eucarióticos está muy aceptado (Boulikas T, "Nature of DNA sequences at the attachment regions of genes to the nuclear matrix", J. Cell Biochem.,

52: 14-22, 1993) . De acuerdo con este modelo la cromatina se organiza en bucles que abarcan 50-100 kb fijados a la matriz nuclear, un retículo proteínico constituido por ribonucleoproteínas (RNP) y otras proteínas no histónicas (Bode J, Stengert-Iber M, Kay V, Schalke T and Dietz-Pfeilstetter A, Crit. Rev. Euk. Gene Exp., 6:115-138, 1996) .

Las regiones de DNA fijadas a la matriz nuclear se denominan SAR (por la expresión inglesa Scaffold Attachment Region) o MAR, para regiones de fijación al armazón (durante la metafase) o a la matriz (interfase) , respectivamente (Hart C and Laemmli U. (1998) , "Facilitation of chromatin dynamics by SARs", Curr. Opin. Genet. Dev. 8, 519-525.)

En este sentido, dichas regiones pueden definir los límites de los dominios de cromatina independientes, de tal modo que sólo los elementos cis-reguladores envolventes controlan la expresión de los genes en el dominio.

Sin embargo, su capacidad para proteger completamente un locus cromosómico de elementos de cromatina cercanos y por consiguiente conferirles una expresión génica independiente de la posición, no ha sido observada en las células establemente transfectadas (Poljak L, Seum C, Mattioni T and Laemmli U. (1994) "SARs stimulate but do not confer position independent gene expression", Nucleic Acids Res 22, 4386-4394) . Por otro lado, se ha demostrado que las secuencias de MAR (o S/MAR) interaccionan con potenciadores para aumentar la accesibilidad a la cromatina local (Jenuwein T, Forrester W, Fernandez-Herrero L, Laible G, Dull M, and Grosschedl R. (1997) "Extension of chromatin accessibility by nuclear matrix attachment regions", Nature, 385, 269-272) . Específicamente, los elementos de MAR pueden potenciar la expresión de genes heterólogos en líneas de cultivos celulares (Kalos M and Fournier R (1995) "Position-independent transgene expression mediated by boundar y elements from the apolipoprotein B chromatin domain", Mol. Cell Biol., 15, 198-207) , ratones transgénicos (Castilla J, Pintado B, Sola I, Sánchez-Morgado J, and Enjuanes L (1998) "Engineering passive immunity in transgenic mice secreting virusneutralizing antibodies in milk", Nat. Biotechnol., 16, 349-354) y vegetales (Allen G, Hall GJ, Michalowski S, Newman W, Spiker S, Weissinger A, and Thompson W (1996) , "High-level transgene expression in plant cells: effects of a strong scaffold attachment region from tobacco", Plant Cell 8, 899-913) . Se reconoce también la utilidad de las secuencias de MAR para desarrollar vectores mejorados para terapia génica (Agarwal M, Austin T, Morel F, Chen J, Bohnlein E, and Plavec I (1998) , "Scaffold attachment region-mediated enhancement of retroviral vector expression in primar y T cells", J. Virol 72, 3720-3728) .

Recientemente, se ha demostrado que las secuencias modificadoras de la estructura de la cromatina que incluyen las MAR, como ha sido ilustrado por la MAR en el extremo 5’ de lisozima de pollo, son capaces de potenciar significativamente la expresión de genes indicadores en mezclas de células de ovario de hámster chino (abreviadamente CHO, por la expresión inglesa Chinese Hamster Ovar y ) (Zahn-Zabal M, et al., "Development of stable cell lines for production or regulated expression using matrix attachment regions", J. Biotechnol, 2001, 87 (1) :

p. 29-42) . Esta propiedad se utilizó para aumentar la proporción de clones de alta producción, reduciendo así el número de clones que necesitan ser cribados. Estos beneficios se han observado tanto en construcciones con las MAR que flanquean la casete de expresión transgénica, como cuando las construcciones son co-transfectadas con las MAR en un plásmido separado. Sin embargo, los niveles de expresión en la co-transfección conjunta con las MAR no eran tan elevados como los observados para una construcción en la que dos MAR delimitan la unidad de expresión transgénica. Se mostró un tercer proceso preferido que era la transfección de transgenes con las MAR tanto unidas al transgén como en un plásmido separado (Girod et al., pendiente de publicación) . Sin embargo, una limitación persistente de esta técnica es la cantidad de DNA que puede ser transfectada por célula. Se han desarrollado muchos protocolos de transfecciones múltiples con el fin de conseguir una alta eficacia de transfección para caracterizar la función de los genes de interés. El protocolo aplicado por Yamamoto et al., 1999 ("High efficiency gene transfer by multiple transfection protocol", Histochem. J. 31 (4) , 241-243) conduce a una eficacia de transfección de aproximadamente 80% después de 5 eventos de transfección, mientras que el protocolo de transfección convencional sólo consiguió una tasa <40%. Aunque esta técnica puede ser útil si se desea aumentar la proporción de células que se expresan, no conduce a células con una mayor productividad intrínseca. Por consiguiente, no se puede emplear para generar líneas de células monoclonales altamente productoras. Por lo tanto, la técnica anteriormente descrita tiene dos inconvenientes principales:

i) esta técnica no genera una población homogénea de células transfectadas, puesto que no puede favorecer la integración de más copias de genes ni dirigir los transgenes a loci cromosómicos favorables,

ii) el uso del mismo marcador seleccionable en múltiples eventos de transfección no permite la selección de células doble o triplemente transfectadas.

En la solicitud de patente WO02/074969, también se ha demostrado la utilidad de las MAR para el desarrollo de líneas de células eucarióticas estables. Sin embargo, esta solicitud no describe ni la homología conservada del elemento DNA de la MAR ni ninguna técnica para predecir la capacidad de una secuencia de DNA para ser una secuencia de MAR.

En efecto, no se ha encontrado ninguna secuencia de consenso neta de MAR (Boulikas T, "Nature of DNA sequences at the attachment regions of genes to the nuclear matrix", J. Cell Biochem., 52:14-22, 1993) sino que por evolución, parece que la estructura de estas secuencias se conserva funcionalmente en genomas eucarióticos, puesto que las MAR de animales se pueden unir a los armazones nucleares de vegetales y viceversa (Mielke C, Kohwi Y, Kohwi-Shigematsu T and Bode J, "Hierarchical binding of DNA fragments derived from scaffold-attached regions: correlation of properties in vitro and function in vivo", Biochemistr y , 29:7475-7485, 1990) .

La identificación de las MAR por estudios bioquímicos es un proceso largo e impredecible; se pueden obtener diferentes resultados dependiendo del ensayo (Razin SV, "Functional architecture of chromosomal DNA domains", Crit. Rev. Eukar y ot. Gene Expr., 6:247-269, 1996) . Considerando el enorme número esperado de MAR en un genoma eucariótico y la cantidad de secuencias obtenidas de los proyectos del genoma, sería de gran utilidad una herramienta capaz de filtrar las MAR potenciales con el fin de realizar experimentos específicos.

Actualmente, están disponibles en Internet dos herramientas diferentes de predicción para las MAR. La primera, el programa informático MAR-Finder (http: //futuresoflorg/MarFinder; Singh GB, Kramer JA and Krawetz SA, "Mathematical model to predict regions of chromatin attachment to the nuclear matrix". Nucleic Acid Research, 25:1419-1425, 1997) se basa en un conjunto identificado de patrones en las diversas MAR y un análisis estadístico de la coexistencia de estos patrones. Las predicciones por el programa MAR-Finder dependen del contexto de la secuencia, lo que significa que las MAR predichas dependen del contexto de la secuencia analizada. El otro programa informático de predicción, el programa SMARTest, (hftp://www. genomatix.de; Frisch M,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una secuencia de DNA aislada y purificada que tiene una actividad que aumenta la producción de proteínas, caracterizada por que dicha secuencia de DNA comprende a) al menos un elemento de DNA curvado, en donde el elemento de DNA curvado contiene al menos 33% del dinucleótido TA y/o al menos 33% del dinucleótido AT en un tramo de 100 pares de bases contiguos, b) al menos un sitio de unión para una proteína de unión a DNA, y porque es una secuencia de nucleótidos de MAR que tiene la secuencia SEQ ID No 27, o una de sus secuencias complementarias, o una secuencia que tiene una identidad de al menos 90% con dicha secuencia SEQ ID No 27.

2. La secuencia aislada y purificada de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que dicha proteína de unión al DNA es un factor de transcripción preferiblemente un factor de transcripción seleccionado del grupo que comprende proteínas del dominio polyQpolyP., o un factor de transcripción seleccionado del grupo que comprende SATB1, NMP4, MEF2, S8, DLX1, FREAC7, BRN2, GATA 1/3, TATA, Bright, MSX, AP1, C/EBP, CREBP1, FOX, Freac7, HFH1, HNF3alfa, Nkx25, POU3F2, Pit1, TTF1, XFD1, AR, C/EBPgamma, Cdc5, FOXD3, HFH3, HNF3 beta, MRF2, Oct1, POU6F1, SRF, V$MTATA_B, XFD2, Bach2, CDP CR3, Cdx2, FOXJ2, HFL HP1, Myc, PBX, Pax3, TEF, VBP, XFD3, Brn2, COMP1, Evil, FOXP3, GATA4, HFN1, Lhx3, NKX3A, POU1F1, Pax6, TFIIA y Vmw65 o una combinación de dos o más de estos factores de transcripción.

3. El uso in vitro de una secuencia de DNA aislada y purificada que comprende una primera secuencia de nucleótidos aislada de la región de fijación a la matriz (MAR) que es una secuencia de nucleótidos de MAR seleccionada del grupo que comprende:

-una secuencia de DNA aislada y purificada de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2,

-la secuencia SEQ ID No 27, o una de sus secuencias complementarias, para aumentar la actividad de producción de proteínas en una célula hospedante eucariótica.

4. El uso de la secuencia de DNA aislada y purificada de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado por que dicha secuencia de DNA aislada y purificada comprende además un promotor unido operativamente a un gen de interés.

5. El uso de la secuencia de DNA aislada y purificada de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, caracterizado por que dicha secuencia de DNA aislada y purificada comprende además al menos una segunda secuencia de nucleótidos aislada de una región de fijación a la matriz (MAR) que es una secuencia de nucleótidos de MAR seleccionada del grupo que comprende:

-una secuencia de DNA aislada y purificada de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2,

-la secuencia SEQ ID No 27, o una de sus secuencias complementarias, para aumentar la actividad de producción de proteínas en una célula hospedante eucariótica.

6. El uso de la secuencia de DNA aislada y purificada de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado por que dicha primera y al menos segunda secuencias de MAR están localizadas en ambos extremos 5’ y 3’ de la secuencia que contiene el promotor y el gen de interés, o en una secuencia distinta de la que contiene el promotor y el gen de interés.

7. Un método de transfección in vitro de una célula hospedante eucariótica, comprendiendo dicho método a) introducir en dicha célula hospedante eucariótica al menos una secuencia de DNA purificada que comprende al menos una secuencia de DNA aislada y purificada que consiste en una secuencia de nucleótidos de MAR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, b) someter en un tiempo definido dicha célula hospedante eucariótica transfectada a al menos una etapa adicional de transfección con al menos una secuencia de DNA purificada que comprende al menos una secuencia de DNA de interés, preferiblemente un gen de interés que codifica un proteína unida de operativamente a un promotor, y/o con al menos una secuencia de DNA aislada y purificada que consiste en una secuencia de nucleótidos de MAR u otros elementos modificadores de la cromatina, y c) seleccionar dicha célula hospedante eucariótica transfectada, preferiblemente seleccionar células hospedantes eucarióticas transfectadas que son células altamente productoras de proteínas con una tasa de producción de al menos 10 pg por célula y por día.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado por que la secuencia de nucleótidos de MAR se selecciona del grupo que comprende:

-una secuencia de DNA aislada y purificada de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2,

-la secuencia SEQ ID No 27, o una de sus secuencias complementarias.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, caracterizado por que el tiempo definido corresponde a intervalos relacionados con el ciclo de división celular.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado por que el tiempo definido es el momento en que la célula hospedante acaba de entrar en el segundo ciclo de división celular.

11. Un método in vitro de transfección de una célula hospedante eucariótica, comprendiendo dicho método cotransfectar en dicha célula hospedante eucariótica al menos una primera secuencia de DNA aislada y purificada, que

comprende al menos una secuencia de DNA de interés, y una segunda secuencia de DNA aislada y purificada que comprende al menos una secuencia de nucleótidos de MAR seleccionada del grupo que comprende:

- una secuencia de DNA aislada y purificada de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2,

- la secuencia SEQ ID No 27 o una de sus secuencias complementarias.

12. Un proceso para la producción de una proteína, en donde a) una célula hospedante eucariótica transfectada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 se cultiva en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína y b) se recupera dicha proteína.

13. Una mezcla o un kit de transfección celular que comprende al menos una secuencia de DNA aislada y purificada de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

14. Una célula hospedante eucariótica transfectada con al menos una secuencia de DNA de acuerdo con la 15 reivindicación 1 ó 2, y/o transfectada con un método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11.

15. Un organismo transgénico no humano, caracterizado por que en su genoma o al menos algunas de sus células tienen establemente incorporada al menos una secuencia de DNA de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

16. El organismo transgénico no humano de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado por que algunas de sus células han sido transfectadas según el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11.

FIG. 2/1

FIG. 2/2

FIG. 2/3

FIG. 2/4


 

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