Renovación y repoblación de tejidos y órganos cadavéricos descelularizados por células madre.

Un método de fabricación de una matriz de tejido para la implantación en un paciente,

que comprende: larecolección de células madre placentarias de una placenta que ha sido tratada para eliminar la sangre del cordón yla siembra de las células madre recolectadas sobre o dentro de una matriz de tejido para la implantación en unpaciente.

Renovación y repoblación de tejidos y órganos cadavéricos descelularizados por células madre Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención radica generalmente en el campo de la ingeniería tisular, y es un medio para la obtención de células madre para su siembra en armazones para la regeneración o reparación de tejido, hueso y otros órganos.

2. Descripción de la técnica anterior

La escasez de donantes de órganos humanos para trasplante es un problema creciente. A pesar de las agresivas campañas de sensibilización pública el número de donantes de órganos cualificados ha cambiado poco en los últimos 20 años mientras que la demanda ha crecido a un ritmo rápido. Además, el trasplante de órganos alogénico está aún asociado con una alta frecuencia de complicaciones debido al rechazo inmunológico. Los intentos de hacer frente a esta crisis han incluido el desarrollo de dispositivos de soporte de órganos sintéticos ex vivo e implantables tales como dispositivos de bomba para soporte cardiaco y el uso de órganos de otras especies (xenotrasplantes) . El xenotrasplante que ha sido refinado para incluir el desarrollo de animales donantes quiméricos todavía sigue siendo imperfecto y estando sujeto a posibles consecuencias tales como la transmisión de zoonosis.

Las células madre humanas son células precursoras totipotenciales o pluripotenciales capaces de generar una variedad de linajes celulares humanos maduros. Esta capacidad sirve como base para la diferenciación celular y la especialización necesaria para el desarrollo de órganos y tejidos. El reciente éxito en el trasplante de estas células madre ha proporcionado nuevas herramientas clínicas para reconstituir y/o complementar la médula ósea después de la mieloablación debida a enfermedad, exposición a sustancias químicas tóxicas o radiación. Existe una evidencia adicional que demuestra que las células madre pueden ser empleadas para repoblar muchos, si no todos, los tejidos y restaurar la funcionalidad fisiológica y anatómica. La evidencia hasta la fecha indica que las células madre multipotentes o pluripotentes están dirigidas a diferenciarse a linajes específicos de células maduras basándose en el entorno físico y bioquímico en el que se liberan. También existe evidencia de que estas células pueden migrar de tejidos normales a anormales o defectuosos y repoblar esas zonas de manera muy centrada y específica.

La aplicación de células madre en la ingeniería tisular, la terapia génica y el tratamiento terapéutico celular también están avanzando rápidamente.

Se han caracterizado muchos tipos diferentes de células madre de mamíferos. Por ejemplo, se conocen las células madre embrionarias, las células germinales embrionarias, las células madre adultas u otras células madre o células progenitoras comprometidas. Ciertas células madre no sólo se han aislado y caracterizado, sino también se han cultivado en condiciones que permiten la diferenciación en una medida limitada.

A pesar de los considerables avances realizados en el control de la diferenciación de células madre a células y tejidos maduros, no se ha logrado el desarrollo real de la compleja arquitectura de los órganos sólidos. Por lo tanto, la ingeniería tisular ha prestado atención a tejidos componentes en desarrollo y a continuación al ensamblaje de esos componentes en estructuras útiles.

Por lo tanto un objeto de la presente invención es proporcionar métodos para eliminar el contenido celular de los tejidos, mientras que se preserva la arquitectura de la matriz extracelular asociada a la comprensión avanzada de las células madre, que se pueden sembrar con células para producir órganos enteros con las características anatómicas y fisiológicas de los órganos nativos.

Compendio de la invención La presente invención se refiere a un método para la fabricación de una matriz tisular para la implantación en un paciente que comprende: recoger células madre placentarias de una placenta que ha sido tratada para eliminar la sangre residual del cordón y sembrar las células madre recogidas sobre o en una matriz tisular para su implantación en un paciente.

Además, la presente invención proporciona una matriz tisular que comprende células madre placentarias humanas, que son SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, y ABC-p+; o CD10+, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, y ABC-p+.

Los órganos sólidos cadavéricos son procesados para eliminar todos los componentes celulares vivos para conservar todavía el armazón de la matriz extracelular subyacente en preparación para la implantación de células madre alogénicas que repueblan el armazón tridimensional del órgano y restaurar la función anatómica y fisiológica normal para fines de trasplante de órganos. En una realización preferida, las células se obtienen a partir de tejido placentario. El método para el procesamiento de órganos sólidos de cadáver agota selectivamente los componentes celulares del órgano a la vez que preserva la arquitectura bioquímica y tridimensional nativa de dicho órgano. En el

armazón del órgano resultante o 'molde' se implantan después las células madre multipotentes vivas de genotipo específico que son liberadas mediante inyección intraparenquimatosa o por medio del árbol vascular del órgano. La liberación de estas células se realiza de una manera que promueve la diferenciación y la proliferación de los tipos de células maduras normales del órgano, estando guiados la distribución y el ensamblaje célula a célula final por el armazón de la matriz extracelular. La repoblación del armazón del órgano se lleva a cabo bajo condiciones de cultivo de ambiente controlado que proporcionan la inmersión en y la perfusión con el medio de cultivo de tejidos formulado para liberar los niveles de nutrientes y metabólicos óptimos necesarios para sostener el órgano, a la vez que se simulan esas fuerzas biomecánicas que se encuentran in vivo. El sistema controla el estado fisiológico y metabólico del órgano durante la repoblación y la renovación y ajusta las condiciones según sea necesario para mantener el estado de equilibrio óptimo. Los órganos repoblados pueden se mantenidos a continuación en estas condiciones de apoyo hasta el momento en que se puedan someter a ensayo y trasplantar.

La presente invención se refiere a métodos de fabricación de un tejido u órgano in vivo. Los métodos de la invención abarcan el uso de células madre de tipo embrionario obtenidas a partir de una placenta que ha sido tratada para eliminar la sangre del cordón residual para sembrar una matriz y cultivada en las condiciones apropiadas para permitir que las células madre se diferencien y pueblen la matriz. Los tejidos y órganos obtenidos por medio de los métodos de la invención se pueden utilizar para una variedad de propósitos, incluyendo fines de investigación y terapéuticos.

En un aspecto, las células madre de tipo embrionario se obtienen a partir de una placenta que se ha exanguinado y perfundido durante un período de al menos de dos a veinticuatro horas después de la expulsión desde el útero para eliminar toda la sangre residual del cordón. La placenta exanguinada se cultiva a continuación en las condiciones apropiadas para permitir la producción de células madre endógenas procedentes de la placenta.

Los métodos de la presente invención se refieren al uso de células madre placentarias que se han originado a partir de una placenta para sembrar una matriz. Una vez obtenidas a partir de una placenta cultivada, las células madre placentarias se pueden caracterizar mediante varios métodos, incluyendo pero no limitados a, inmunoquímica, y la presencia de marcadores de superficie celular concretos. Las células madre preferidas para ser utilizadas de acuerdo con la presente invención pueden ser identificadas por la presencia de los siguientes marcadores de superficie celular: CD10+, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, y APC-p+.

De acuerdo con los métodos de la presente invención, las células madre se pueden diferenciar a linajes celulares específicos, incluyendo los linajes adipogénico, condrogénico, osteogénico, neurogénico y hepatogénico. En otra realización de la invención, puede ser preferible estimular la diferenciación de células madre placentarias a un linaje concreto, antes de la siembra de las células en una matriz concreta. De acuerdo con esta realización, las placentas cultivadas se pueden estimular para producir células de un linaje concreto, mediante la introducción en la placenta de células o tejidos exógenos del linaje deseado.... [Seguir leyendo]

1. Un método de fabricación de una matriz de tejido para la implantación en un paciente, que comprende: la recolección de células madre placentarias de una placenta que ha sido tratada para eliminar la sangre del cordón y la siembra de las células madre recolectadas sobre o dentro de una matriz de tejido para la implantación en un paciente.

2. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la perfusión de una placenta que se ha drenado de sangre del cordón, con una solución anticoagulante para eliminar mediante lavado las células madre placentarias residuales y la recogida de dichas células madre placentarias residuales y del líquido de perfusión procedente de la placenta drenada para la siembra en o sobre la matriz de tejido.

3. Un método como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende adicionalmente la separación de dichas células madre placentarias de dichas células residuales y del líquido de perfusión, preferiblemente mediante centrifugación, antes de la siembra de la matriz de tejido.

4. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la placenta se perfunde con la solución anticoagulante haciendo pasar la solución anticoagulante a la arteria umbilical y/o la vena umbilical.

5. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las células madre placentarias residuales y el líquido de perfusión se recogen de la parte de la placenta que estaba unida a la pared del útero de la madre.

6. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las células placentarias son humanas.

7. Un método como se reivindica en la reivindicación 6, en donde dichas células madre placentarias humanas son SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, y ABC-p+.

8. Un método como se reivindica en la reivindicación 6, en donde dichas células madre placentarias humanas son CD10+, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, y ABC-p+.

9. Un método como se reivindica en la reivindicación 6, en donde dichas células madre placentarias humanas son SH2+, SH3+ y SH4+.

10. Un método como se reivindica en la reivindicación 6, en donde dichas células madre placentarias humanas son células madre de tipo MSC adherentes a plástico de cultivo de tejido, fibroblastoides.

11. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la placenta es estimulada con células exógenas antes de sembrar las células madre recogidas sobre o en la matriz de tejido.

12. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dichas células madre se obtienen de una placenta que ha sido perfundida durante al menos 2 horas.

13. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dichas células madre se obtienen de una placenta que ha sido perfundida durante al menos 12 horas.

14. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dichas células madre se obtienen de una placenta que ha sido perfundida durante al menos 24 horas.

15. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde dicha matriz de tejido es un tejido descelularizado.

16. Un método como se reivindica en la reivindicación 15, en donde el tejido descelularizado se lava para garantizar la eliminación de los restos celulares y extracelulares antes de la siembra y lo más preferiblemente también se trata con factores que potencian la adherencia y la migración al interior de las células madre placentarias antes de la siembra.

17. Un método como se reivindica en la reivindicación 15 o 16, en donde dicho tejido descelularizado se pone en contacto con suero y fibronectina antes de dicha siembra.

18. Un método como se reivindica en la reivindicación 17, en donde dicho tejido descelularizado se pone en contacto adicionalmente con un glicosaminoglicano antes de dicha siembra.

19. Un método como se reivindica en la reivindicación 18, en donde dicho glicosaminoglicano es la heparina.

20. Un método como se reivindica en la reivindicación 19, en donde fibronectina y dicha heparina están presente en una proporción de aproximadamente 0, 1:1 a aproximadamente 10, 0:1 de fibronectina:heparina.

21. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la matriz de tejido se forma a partir de polímeros naturales o sintéticos.

22. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde dicha matriz de tejido es una matriz de tejido artificial.

23. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o 21, en donde dicha matriz de tejido es una matriz de tejido producida a partir de tejido natural.

24. Un método como se reivindica en la reivindicación 23, en donde dicho tejido es un órgano o parte de un órgano.

25. Una matriz de tejido que comprende células madre placentarias humanas, que son SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, y

ABC-p+; o CD10+, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, y 10 ABC-p+.

26. Una matriz de tejido como se reivindica en la reivindicación 25 para su uso en un método de reparación o sustitución de tejido en un paciente.