Purificación y estabilización de agentes farmacéuticos a base de péptidos y proteínas.

Un método de purificar un péptido que comprende

proporcionar micropartículas preformadas de una dicetopiperazina en una suspensión;

proporcionando una composición de péptido conteniendo una impureza a eliminar;

formar un complejo del péptido con las microparticulas preformadas de la dicetopiperazina; y

eliminar esencialmente todas las impurezas del complejo lavando con un no-disolvente para el péptido y dicetopiperazina.

El método de la Reivindicación 1 en donde el péptido o proteína se selecciona del grupo consistiento en insulina, calcitonina de salmón, hormona paratiroidea1-34, octreotida, leuprolida, y péptido RSV.

Purificación y estabilización de agentes farmaceúticos a base de péptidos y proteínas

Antecedentes de la Invención [0001] La presente invención está en general en el campo de las formulaciones farmaceúticas, y más particularmente relacionada con los métodos y composiciones para purificar y estabilizar péptidos y proteínas, tales como insulina, que son utilizados en aplicaciones farmacéuticas.

En una persona normal, las células β de los islotes pancreáticos de Langerhans producen insulina, necesitada por el cuerpo para el metabolismo de la glucosa, como respuesta a un incremento de la concentración de glucosa en la sangre. La insulina metaboliza la glucosa entrante y para temporalmente la transformación por el hígado de glucógeno y lípidos a glucosa permitiendo de ese modo al cuerpo soportar actividad metabólica entre comidas. El diabético Tipo I, sin embargo, tiene una capacidad reducida o total incapacidad de producir insulina debido a la destrucción de células β y necesita reemplazar la insulina por medio de inyecciones diarias o una bomba de insulina. Pero, más común que el Tipo I de diabetes, es el Tipo II de diabetes, que se caracteriza por resistencia a la insulina y función pancreática crecientemente dañada de las células β. El Los diabéticos Tipo II pueden todavía producir insulina, pero pueden también requerir terapia de sustitución de insulina.

Los diabéticos de Tipo II normalmente presentan una respuesta retrasada a incrementos en los niveles de glucosa en sangre. Mientras las personas normales normalmente liberan insulina en 2-3 minutos tras el consumo de alimentos, los diabéticos de Tipo II pueden no segregar insulina endógena durante varias horas tras el consumo. Como resultado, la producción de glucosa endógena continúa tras el consumo (Pfeiffer, Am. J. Med, 70:579-88 (1981) ) , y el paciente experimenta hiperglucemia debido a níveles elevados de glucosa en sangre.

La pérdida de secreción de insulina provocada por glucosa es una de las perturbaciones más tempranas de la función de las células β (Cerasi et al., Diabetes, 21:224-34 (1972) ; Polonsky et al., N. Engl. J. Med, 318:1231-39 (1988) ) , pero las causas y el grado de disfunción de las células β cell se desconocen en la mayoría de los casos.

Mientras que los factores genéticos juegan un papel importante, (Leahy, Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes, 2:300-06 (1995) ) , algunas perturbaciones de la secreción de insulina parecen ser adquiridas y pueden ser al menos parcialmente reversibles a través mediante un control óptimo de la glucosa. El control óptimo de la glucosa por medio de la terapia de insulina tras una comida puede llevar a una significativa mejora de la liberación natural de insulina provocada por glucosa requiriendo tanto una respuesta normal del tejido a la insulina administrada como un aumento brusco en las concentraciones de insulina en suero. Por lo tanto, el desafio presentado en el tratamiento de los diabéticos de Tipo II en la primera fase, aquéllos que no tienen pérdida excesiva de función de las células β, es restaurar la liberación de insulina después de las comidas.

La mayoría de los diabéticos Tipo II de fase temprana son tratados con agentes orales, pero con poco éxito. Las inyecciones subcutáneas de la insulina son también raramente eficazs para proporcionar insulina a los diabéticos Tipo II y pueden realmente empeorar la acción de la insulina a causa de un comienzo de acción retrasado, variable, y superficial. Se ha demostrado, sin embargo, que si la insulina es administrada intravenosamente con una comida, los diabéticos Tipo II de fase temprana experimentan el paro de glucogénesis hepática y presentan un control aumentado de la glucosa fisiológica. Además, sus níveles de ácidos grasos libres caen a un ritmo más rápido que sin la terapia de insulina. Mientras que posiblemente es eficaz en tratar diabetes de Tipo II, la administración intravenosa de insulina no es una solución razonable, ya que no es seguro o factible para los pacientes administrar intravenosamente insulina en cada comida.

La insulina, un polipéptido con un peso molecular nominal de 6, 000 Daltons, ha sido producida tradicionalmente procesando páncreas de cerdo y vaca para aislar el producto natural. Más recientemente, sin embargo, se ha usado tecnología recombinante para producir insulina humana in vitro. La insulina humana natural y recombinante en solución acuosa está en una configuración hexamérica, es decir, seis moléculas de insulina recombinante se asocian no covalentemente en un compeljo hexamérico cuando se disuelve en agua en presencia de iones de cinc. La insulina hexamérica no se absorbe rápidamente. Con el fin de que la insulina humana sea absorbida dentro de la circulación del paciente, la forma hexamérica debe primero asociarse en formas diméricas y/o monoméricas antes de que la sustancia pueda moverse dentro del flujo sanguíneo. El retraso en la absorción requiere que la insulina humana recombinante sea administrada aproximadamente una media hora antes de la hora de la comida con el fin de producir el nivel terapéutico sanguíneo de insulina, lo cual puede ser agobiante para pacientes a los que se requiere que anticipen los momentos en que comerán. Para superar este retraso, se han desarrollado análogos de la insulina recombinante humana, tales como HUMALOG™, que rápidamente se disocian en una forma virtualmente monomérica totalmente tras administración subcutánea. Estudios clinicos han demostrado que HUMALOG™ es absorbido cuantitativamente más rápido que la insulina humana recombinante tras administración subcutánea. Ver, por ejemplo, la Patente estadounidense nº 5, 547, 929 a Anderson Jr., et al.

En un esfuerzo de evitar las desventajas asociadas con la administración por inyección y para acelerar la absorción, se ha desarrollado la administración de análogos monoméricos de insulina via pulmonar. Por ejemplo, la Patente US nº 5.888.477 a Gonda, et al. revela hacer a un paciente inhalar una fórmula en aerosol de insulina monomérica para depositar partículas de insulina en el tejido del pulmón del paciente. Sin embargo, la fórmula monomérica es inestable y rápidamente pierde actividad, mientras que la tasa de captación permanece inalterada. [0008] Mientras que sería deseable producir insulina rápidamente absorbible derivada de fuentes naturales, la transformación de la forma hexamérica en la forma monomérica, tal como eliminando el cinc del complejo, da una insulina que es inestable y tiene una vida útil indeseablemente corta. Por tanto sería deseable proporcionar formar monoméricas de insulina, manteniendo al tiempo su estabilidad en la ausencia de cinc. También sería ventajoso proporcionar a los pacientes diabéticos con composiciones de insulina monomérica que sean adecuadas para la administración pulmonar, proporcionen rápida absorción, y que puedan ser producidas en formulaciones listas para usar que tengan un tiempo de caducidad comercialmente útil.

Estos problemas con impurezas, iones de metal que afectan a la estabilidad o biiodisponibilidad, suceden con muchas otras proteínas y péptidos.

La patente US nº 6.071.497 a Steiner, et al. revela sistemas de administración de fármacos en micropartículas en los cuales el fármaco es encapsulado en micropartículas de dicetopiperazina que son estables a un pH de 6.4 o menos e inestables a pH de más de 6.4, o que son estables tanto con pH ácido como básico, pero que son inestables a pH entre alrededor de 6.4 y 8. La patente no describe composiciones de insulina monomérica que sean adecuadas para administración pulmonar, proporcionen rápida absorción, y que puedan ser producidas en formulaciones listas para usar que tengan un tiempo de caducidad comercialmentemente util.

Sería por tanto ventajoso desarrollar composiciones alternativas de administración de insulina para Diabéticos Tipo II que proporcionen elevación más rápida de los níveles sanguineos de insulina y sean fácilmente administradas para asegurar la conformidad del paciente. Sería deseable aplicar las composiciones y métodos de administración a otros agentes biológicamente activos.

Es por tanto un objeto de la presente invención proporcionar métodos mejorados para purificar péptidos y proteínas, especialmente en la preparación de composiciones adecuadas para administración pulmonar.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar composiciones estables de péptidos monoméricos adecuadas para administración pulmonar.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar métodos y composiciones para el transporte facilitado de insulina y otros péptidos biologicamente activos a... [Seguir leyendo]

1. Un método de purificar un péptido que comprende

proporcionar micropartículas preformadas de una dicetopiperazina en una suspensión; proporcionando una composición de péptido conteniendo una impureza a eliminar;

formar un complejo del péptido con las microparticulas preformadas de la dicetopiperazina; y

eliminar esencialmente todas las impurezas del complejo lavando con un no-disolvente para el péptido y dicetopiperazina.

El método de la Reivindicación 1 en donde el péptido o proteína se selecciona del grupo consistiento en insulina, calcitonina de salmón, hormona paratiroidea1-34, octreotida, leuprolida, y péptido RSV.

3. El método de la Reivindicación 1 en donde la impureza es un ión multivalente.

4. El método de la Reivindicación 2 en donde el péptido es un complejo de insulina y la impureza es un ión de cinc.

5. Una composición para la administración de un péptido a un paciente, que comprende un péptido complejado con una dicetopiperazina; en donde la composición se obtiene combinando el péptido con micropartículas preformadas de la dicetopiperazina para formar una cobertura del péptido sobre las micropartículas y el péptido es una hormona, citoquina u otro péptido inmunomodulatorio, antígeno o vacuna.

6. La composición de la Reivindicación 5 en donde el péptido es insulina dimérica o monomérica.

7. La composición de la Reivindicación 5 en donde el péptido es glucagón.

8. La composición de la Reivindicación 6 en donde el péptido está sustancilamente libre de iones de cinc.

9. La composición de cualquiera de las Reivindicaciones 5-8 en donde las micropartículas se proporcionan en forma de un polvo seco.

10. La composición de cualquiera de las Reivindicaciones 5-8 en donde las micropartículas se proporcionan como una suspensión acuosa en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. La composición de cualquiera de las Reivindicaciones 5, 8 o 9 la cual está en una forma adecuada para administración pulmonar.

12. La composición de la Reivindicación 5 hecha por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

13. Uso de micropartículas formadas de un complejo de (i) un agente activo y (ii) una cantidad eficaz de dicetopiperazina, en donde el complejo se forma combinando micropartículas preformadas de dicetopiperazina con el agente activo, en la elaboración de un medicamento para tratamiento terapéutico o profiláctico por administración del agente activo a una membrana mucosal en donde el agente activo es un péptido terapéutico, profilactico o diagnostico.

14. Micropartículas formadasde un complejo de (i) un agente activo y (ii) una cantidad eficaz de dicetopiperazina, en donde el complejo se forma combinando micropartículas preformadas de dicetopiperazina con el agente activo, para uso en tratamiento terapéutico o profiláctico por administración del agente activo a una membrana mucosal en donde el agente activo es un péptido terapéutico, profiláctico o diagnóstico.

15. El uso de la Reivindicación 13 o las micropartículas de la Reivindicación 14, en donde el agente activo es una molécula cargada.

16. El uso de cualquiera de las 1. o 15 o las micropartículas de cualquiera de las 1. o 15, en donde la composición se administra a los pulmones por medio de inhalación.

17. El uso de micropartículas de una dicetopiperazina en el que se compleja insulina monomérica o dimérica con la dicetopiperazina, en donde la insulina está sustancialmente libre de cinc, y en donde el complejo se forma combinando micropartículas preformadas de la dicetopiperazina con insulina, en la elaboración de un medicamento para administrar insulina a un paciente en necesidad de la misma.

18. Micropartículas de una dicetopiperazina en las que la insulina monomérica o dimérica se compleja con la dicetopiperazina, en donde la insulina está sustancialmente libre de cinc, y en donde el complejo se forma combinando micropartículas preformadas de la dicetopiperazina con insulina para uso en la administración de insulina a un paciente en necesidad de la misma.

19. El uso de la Reivindicación 17 o las micropartículas de la Reivindicación 18, en donde la composición está en forma de un polvo seco adecuada para administración a los pulmones por medio de inhalación.

20. Micropartículas formadas de un complejo de (i) un agente activo y (ii) una cantidad eficaz de una dicetopiperazina, en donde el complejo se forma combinando micropartículas preformadas de dicetopiperazina con el agente activo, para uso en medicina en donde el agente activo es una hormona de péptido, citoquina u otro péptido inmunomodulatorio, antígeno o vacuna.

21. Micropartículas de una dicetopiperazina en las que se compleja insulina monomérica o dimérica, y en donde el complejo se forma combinando micropartículas preformadas de la dicetopiperazina con insulina, para uso en medicina.

22. Micropartículas de la Reivindicación 21 para uso en el tratamiento de diabetes de Tipo II.

23. Un método para estabilizar un péptido que comprende proporcionar micropartículas preformadas de una dicetopiperazina en una suspensión; proporcionar un péptido; formar un complejo del péptido con una cantidad eficaz de las micropartículas preformadas de dicetopiperazina

para estabilizar el péptido.

24. Una composición para la administración de un péptido, en donde el péptido es estabilizado según el método de la Reivindicación 23.

25. Una formulación para el uso en medicina que comprende insulina complejada con una dicetopiperazina y en donde el complejo se forma combinando micropartículas preformadas de la dicetopiperazina con la insulina, que cuando es administrado a un paciente en una cantidad eficaz, produce una concetración máxima de insulina en sangre en el paciente, lo que simula un respuesta normal al alimento, en donde la formulación está en una forma adecuada para la administración por inhalación u oralmente.

26. La formulación de la Reivindicación 25 administrada por inhalación.

27. La formulación de la Reivindicación 26, en donde la dicetopiperazina es dicetopiperazina de fumarilo y la concentración máxima de insulina en sangre se alcanza en unos 13 minutos tras la administración.

28. La formulación de la Reivindicación 26 que comprende insulina, en donde la concentración máxima de insulina en sangre se logra en un periodo de tiempo entre 3 a 10 minutos tras la administración.

29. Una formulación para uso en medicina que comprende un péptido complejado con una dicetopiperazina por combinación de micropartículas preformadas de la dicetopiperazina con el péptido; cuya formulación, cuando se administra a un paciente por administración pulmonar, proporciona una concentración máxima en sangre entre 3 a 10 minutos tras la administración, y en donde el péptido es insulina, calcitonina de salmón, hormona paratiroidea134, octreotida, leuprolida o péptido RSV.

30. La formulación de cualquiera de las Reivindicaciones 25 a 29 en la forma de un polvo seco.

31. Uso de una composición comprendiendo insulina complejada con una dicetopiperazina y en donde el complejo se forma combinando micropartículas micropartículas preformadas de la dicetopiperazina con la insulina, para la elaboración de un medicamento para tratar diabetes de Tipo II el cual, cuando se administra a un paciente en una cantidad eficaz produce una concentración máxima de insulina en sangre, lo que simula una respuesta normal a la comida, en donde la formulación está en una forma adecuada para administración por inhalación u oralmente.

32. Una composición comprendiendo insulina complejada con una dicetopiperazina y en donde el complejo se forma combinando micropartículas preformadas de la dicetopiperazina con la insulina, para uso en tratar diabetes de Tipo II que, cuando se administra a un paciente en una cantidad eficaz produce una concentración máxima de insulina en sangre en el paciente, lo que simula una respuesta normal a la comida, en donde la formulación está en una forma adecuada para administración por inhalación u oralmente.

33. Un método de complejar un péptido con una dicetopiperazina que comprende:

(i) proporcionar una suspensión de micropartículas de dicetopiperazina,

(ii) proporcionar una solución del péptido, y

(iii) combinar la suspensión y la solución para formar un complejo del péptido y las micropartículas de dicetopiperazina.

34. El método de la Reivindicación 33 que además comprende eliminar el disolvente por liofilización.

35. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 2, 23, 33 o 34 o el uso o las micropartículas de la Reivindicación 15, o la composición de la Reivindicación 24, en donde el agente activo es insulina.

36. El método de la Reivindicación 35 cuando depende de cualquiera de las Reivindicaciones 33 a 34, en donde la insulina complejada es insulina monomérica o dimérica.

37. El método de la Reivindicación 35 cuando depende de cualquiera de las Reivindicaciones 33 a 34, o la Reivindicación 36, en donde la insulina es estable.

38. El uso de una formulación de administración para insulina monomérica o dimérica comprendiendo una cantidad eficaz de insulina complejada con un derivado de dicetopiperazina, en donde la formulación de administración se prepara complejando insulina con micropartículas del derivado de dicetopiperazina, y en donde las micropartículas liberan insulina monomérica o dimérica por disociación, en la elaboración de un medicamento para administrar insulina monomérica o dimérica a un paciente en necesidad de la misma.

39. Una formulación de administración para insulina monomérica o dimérica comprendiendo una cantidad eficaz de insulina complejada con un derivado de dicetopiperazina, en donde la formulación de administración se prepara complejando insulina con micropartículas del derivado de dicetopiperazina, y en donde las micropartículas liberan insulina monomérica o dimérica por disociación, para uso en la medicina.

40. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1-4, la composición de cualquiera de las Reivindicaciones 5-12, el uso de cualquiera de las 1. o 15 a 17 o 19, las micropartículas para uso conforme a cualquiera de las Reivindicaciones 14, 18 o 20 a 22, el método de la Reivindicación 23, la composición de la Reivindicación 24, la formulación de cualquiera de las Reivindicaciones 25 a 30, el uso de la Reivindicación 31, la composición de la Reivindicación 32, el método de cualquiera de las Reivindicacione.

3. 37, el uso de la Reivindicación 38 o la formulación de la Reivindicación 39, en donde la dicetopiperazina es dicetopiperazina de fumarilo .

41. El método de la Reivindicación 1 o 23, la composición de la Reivindicación 5, el uso de la Reivindicación 13, 16 o 38, la formulación de la Reivindicación 39, o las micropartículas de cualquiera de las Reivindicaciones 14, 18 o 20 en donde el derivado de dicetopiperazina tiene la fórmula 2, 5- diceto-3, 6-di (4-X-aminobutil) piperazina, en donde X es seleccionado del grupo consistente de fumarilo, succinilo, maleilo, y glutarilo.

42. El uso de la reivindicación 17, 19 o 38, o las micropartículas de la Reivindicación 18 o 19 o la fórmula de la Reivindicación 39, en donde la formulación de administración está en forma de un polvo seco adecuado para administración a los pulmones por inhalación.

43. El uso de la reivindicación 17, 19 o 38, o las micropartículas de la Reivindicación 18 o 19 o la formulación de la Reivindicación 39, en donde el paciente es un diábetico de Tipo II.

44. El uso de la reivindicación 43, las micropartículas de la reivindicación 43 o la formulación de la reivindicación 43 en donde la composición o formulación de administración es para administración al paciente concurrentemente con,

o menos de unos 20 minutos antes de que el paciente tome una comida.

45. El uso de la reivindicación 17, 19 o 38, las micropartículas de la Reivindicación 18 o 19 o la formulación de la Reivindicación 39, en donde la formulación de administración se provee en una o más dosis unitarias de insulina, cada dosis equivalente a unas 6 IU de insulina.