Purificación y análisis de ADN en superficies formadas mediante nanoingeniería.

Un dispositivo (160) que comprende:

(a) un puerto de entrada (168);

(b) un puerto de salida (170); y

(c) un único canal de unión (162) en comunicación líquida con el puerto de entrada y el puerto de salida, en elque dicho canal de unión tiene una sección transversal rectangular, y una pared superior, una pared inferior, ydos paredes laterales, y en el que una o dos de dichas paredes es una superficie de cristal lisa sin modificar paraunión de ácidos nucleicos y las otras paredes son de plástico.

Purificación y análisis de ADN en superficies formadas mediante nanoingeniería

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención La presente invención se refiere en general a la purificación de ADN, en particular, al uso de superficies formadas mediante nanoingenieria en la purificación y análisis de ADN.

2. Descripción de la técnica anterior

Se requiere tecnología para simplificar el aislamiento, manipulación y determinación del AND genómico para aplicaciones en diagnóstico medico o de biodefensa portátiles. La calidad del ácido nucleico aislado de tejido humano es crucial para que los datos del análisis genético sean reproducibles, precisos y proporcionen información. Dado que la importancia comercial de los productos para aislamiento de ADN ha aumentado se han realizado muchos trabajos en esta área.

Una técnica en la que se han realizado muchos progresos es el uso de dispositivos microfluidos para realizar análisis genéticos. Se dispone de muchos formatos de ensayo en micromatriz y comparten la capacidad para permitir la interrogación simultánea de un gran número de dianas genéticas a partir de una única muestra.

Ya se han desarrollado ensayos de fase en solución sensibles para medir la concentración del ADN bicatenario (ADNds) usando moléculas de unión (MU) a ranuras minoritarias fluorogénicas. Cuando no hay ADN presente, la molécula puede rotar libremente en solución, lo que es crucial para su fondo fluorescente bajo. Tras la unión al ADNds, el compuesto asume una conformación planar rígida en la ranura minoritaria hidrofóbica que ha aumentado la fluorescencia. Cuidadosamente sometiendo a ingeniería la unión de las MU fluorogénicas a las superficies se puede medir la cantidad de ADN a medida que se transfiere a través de un dispositivo microfluídico.

Los documentos US 2001/026921, WO 2005/066343, US 2003/138941, US 5, 587, 128, US 2004/ 152 085 y Joon-Ho Kim y col.: Proceedings of the IEEE 15th Annual International Conference on Micro Electro Mechanical Systems. MEMS 2002. Las Vegas, NV, Jan. 20 -24, 2002; [IEEE International Micro Electro Mechanical Systems Conference], New York, NY: Ivol. Conf. 15, 1 Januar y 2002 (2002-01-01) , páginas 133-136; Boom y col., J. CI. Microbiol., vol. 28,

páginas 495-503, 1990 and Vogelstein y col., PNAS. USA, vol. 76, páginas 615-619, 1979 divulgan el uso de superficies modificadas para captura de ácido nucleico.

Por tanto, se proporciona un objeto de la presente invención para proporcionar un dispositivo microfluídico que aísla de forma simultánea el ADN genómico, mide la cantidad del ADN purificado y distribuye las soluciones de ADN estandarizado de concentración específica para el análisis campo abajo.

También se proporciona un dispositivo microfluídico para aislar y preparar ADN en el que el coste y la complejidad del dispositivo se minimizan.

Se describe un dispositivo microfluídico que pueda capturar simultáneamente ADN bicatenario (ADNds) de campos biológicos y medir la cantidad de ADN inmovilizado.

También se describe la síntesis de agentes de unión (MU) a ranuras minoritarias fluorogénicos con grupos ligadores electrofílicos o nucleofílicos y demostrar el incremento de la fluorescencia en presencia de ADNds.

Estos y otros objetos de la presente invención se pondrán de manifiesto con mayor facilidad a partir de las descripciones y figuras siguientes.

Breve descripción de las figuras 55 La FIG. 1 es una representación de la estructura de Hoechst 33258 unido a un dúplex de ADN sintético de 12 unidades; La FIG. 2 muestra la estructura de análogos reactivos de H33258 desarrollados para la unión a ligadores en sondas de ADN; La FIG. 3 es una representación de la interacción de dos fluidos que fluyen dentro de un dispositivo microfluídico; La FIG. 4 es una representación de varias superficies modificadas con amina con agentes de unión (MU) a ranuras minoritarias fluorogénicos. La FIG. 5 muestra la síntesis de MU fluorogénicas con grupos reactivos;

La FIG. 6 es una representación de la activación de las superficies de cristal modificadas con aminas de una lámina con cloruro cianúrico en una solución orgánica;

La FIG. 7 muestra posibles diseños de cámaras para un dispositivo microfluídico para usar en la presente invención; La FIG. 8 es una vista frontal de una tarjeta microfluídica adecuada para usar en la presente invención;

La FIG. 9 es una vista en despiece ordenado de una tarjeta microfluídica con sus capas separadas. Las FIGS. 10 A-E, en conjunto, representan una vista frontal de la tarjeta de la FIG. 9 que muestra la secuencia de eventos de la tarjeta durante el uso; La FIG. 11 muestra la síntesis de un pigmento de Hoechst fluorogénico con un ligador de hexilamina unido; La FIG. 12 es un gráfico que muestra la fluorescencia de la molécula BB-NH2 frente a BB-OH excitada a 360 nm. La FIG. 13 es un gráfico que muestra la fluorescencia a 460 nm para cuatro superficies de bisbencimida diferentes; y La FIG. 14 es un gráfico que muestra la cantidad de ADN unido frente a la cantidad de ADN ofrecida para cubreobjetos de cristal y de plástico.

Descripción de las realizaciones preferidas Ya se han desarrollado ensayos de fase en solución sensibles para medir la concentración del ADNds usando moléculas de unión (MU) a ranuras minoritarias fluorogénicas (Hoechst 33258) . Cuando no hay ADN presente, la molécula puede rotar libremente en solución, lo que es crucial para su fondo fluorescente bajo. Tras la unión al ADNds, el compuesto asume una conformación planar rígida en la ranura minoritaria hidrofóbica que ha aumentado la fluorescencia. Cuidadosamente sometiendo a ingeniería la unión de las MU fluorogénicas a las superficies se puede medir la cantidad de ADN a medida que se transfiere a través de un dispositivo microfluídico. Se usa química de conjugación para colocar los fluoros sobre estructuras macromoleculares diseñadas para maximizar la flexibilidad

conformacional y acceder al ADN diana.

La molécula Hoechst 33258 tiene una estructura policíclica que puede formar una estructura con forma de media luna que es isohelicoidal con la ranura minoritaria de ADN de forma B. La FIG. 1 muestra la estructura de RMN en solución de Hoechst 33258 unido a un dúplex de ADN sintético de 12 unidades (número ID de la estructura de PDB: 1QSX) . El extremo fenol de la molécula con forma de media luna es un punto de unión conveniente para la unión en grupos conjugados. La estructura en solución acuosa es flexible y relativamente no fluorescente. La excitación de la molécula sin unir con luz a 356 nm da una fluorescencia débil a 492 nm. No obstante, cuando se unieron al ADNds, los anillos de bencimidazol se fijan en una conformación planar y se desarrolla un sistema aromático extenso que emite una fuerte fluorescencia a 458 nm. La molécula se oculta de las moléculas de agua en la ranura minoritaria y

esto incrementa adicionalmente la fluorescencia. Estas propiedades fluorogénicas de H33258 han conducido al desarrollo de ensayos sensibles para medir las concentraciones de ADNds y, como un ensayo simple, para el recuento de células.

Ha habido mucho interés en la estructura de H33258 unido al ADN. La MU se sujeta en su sitio mediante una combinación de interacciones hidrofóbicas, fuerzas de van der Waals y puentes de hidrógeno mediante los residuos de imidazol. La fuerte unión de H33258 a las ranuras minoritarias puede también proporcionar un mecanismo para aislamiento directo del ADNds. Se prefiere la unión a las ranuras minoritarias de las MU a las secuencias ricas en adenina/timina (A/T) y las constantes de unión a ADN pueden ser órdenes de magnitud mayores que otros agentes de PM pequeño tales como intercalantes. Los agentes fluorogénicos intercalantes también se han explorado 45 extensamente. Un ejemplo de esta clase de agentes de unión a ADN es el bromuro de etidio, que se usa frecuentemente en biología molecular para teñir ADN en geles tras electroforesis. Los pigmentos de metidio se han unido a partículas de sefarosa para proporcionar un producto de aislamiento de ADN. Los pigmentos intercalantes como el metidio no son una unión tan fuerte como la clase de pigmentos de unión a las ranuras minoritarias. El metidio se unió a partículas de sefarosa usando un ligador de espermita catiónica y esto, sin duda, mejoró la unión del ADN. Además, el etidio solo muestra un pequeño incremento en el rendimiento cuántico tras la unión a ADNds. Las propiedades fluorescentes de las partículas de sefarosa-metidio no se describieron.

Los pigmentos intercalantes de tipo cianuro son mucho más fluorogénicos que los intercalantes de etidio. El naranja... [Seguir leyendo]

1. Un dispositivo (160) que comprende:

(a) un puerto de entrada (168) ;

(b) un puerto de salida (170) ; y

(c) un único canal de unión (162) en comunicación líquida con el puerto de entrada y el puerto de salida, en el que dicho canal de unión tiene una sección transversal rectangular, y una pared superior, una pared inferior, y dos paredes laterales, y en el que una o dos de dichas paredes es una superficie de cristal lisa sin modificar para

unión de ácidos nucleicos y las otras paredes son de plástico.

2. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que los ácidos nucleicos son ADN bicatenarios o ADN monocatenarios.

3. dispositivo de la reivindicación 1, en el que los ácidos nucleicos son ARN. 15

4. El dispositivo de la reivindicación 1que además comprende medios para cuantificar los ácidos nucleicos.

5. Un procedimiento para capturar ácidos nucleicos de soluciones salinas caotrópicas, que comprende pasar una solución salina caotrópica que contiene ácidos nucleicos a través de un dispositivo (160) de acuerdo con la

reivindicación 1, de modo que la solución que contiene ácidos nucleicos se pone en contacto con la superficie de cristal lisa sin modificar para proporcionar ácidos nucleicos inmovilizados.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que los ácidos nucleicos inmovilizados son ADN bicatenarios o ADN

monocatenarios. 25

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que los ácidos nucleicos inmovilizados son ARN.

8. El procedimiento de la reivindicación 5, que además comprende lavar los ácidos nucleicos inmovilizados.

9. El procedimiento de la reivindicación 5 u 8, que comprende liberar los ácidos nucleicos inmovilizados de la superficie de cristal para proporcionar ácidos nucleicos liberados.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, que además comprende cuantificar los ácidos nucleicos liberados.