Proteínas verdes fluorescentes modificadas y método para la utilización de las mismas.

Ácido nucleico aislado, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína fluorescentemodificada genéticamente,

cuya secuencia de aminoácidos tiene, como mínimo, el 80% de identidad de la secuenciacon la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, y cuya secuencia de aminoácidos difiere de la secuencia deaminoácidos de la SEQ ID NO: 2, como mínimo, en una sustitución de aminoácido F220L, y comprende unasecuencia de aminoácidos que tiene, como mínimo, el 95% de identidad con la secuencia de aminoácidosseleccionada del grupo que comprende las SEQ ID 18, 20, 22, y 24.

Proteínas verdes fluorescentes modificadas y método para la utilización de las mismas Sector de la invención La presente invención se refiere, en general, al campo de la biología y la química. De manera más particular, la presente invención se refiere a proteínas fluorescentes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se descubrió que la proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés) de la hidromedusa Aequorea victoria (sinónimo de A. A.) , dada a conocer por Johnson y otros en J Cell Comp Physiol. (1962) , 60:85-104, formaba parte del sistema bioluminiscente de la medusa, en el que la GFP jugaba el papel de emisor secundario transformando la luz azul de la fotoproteína aecuorina en luz verde.

El ADNc que codificaba la GFP de A. victoria fue clonado por Prasher y otros (Gene, 1992, V. 111 (2) , pág. 229-233) . Resultó que este gen se puede expresar manera heterológica prácticamente en cualquier organismo debido a la capacidad única de la GFP para formar un fluoróforo por sí mismo (Chalfie y otros, Gene (1992) , 111 (2) :229-233) . Este descubrimiento abre amplias perspectivas para la utilización de la GFP en biología celular como marcador fluorescente codificado genéticamente.

Se está realizando mucha investigación para mejorar las propiedades de la GFP y para producir reactivos de GFP útiles y se está optimizando para una serie de objetivos de investigación. Se han desarrollado nuevas versiones de GFP, tales como un ADN de GFP “humanizado”, cuyo producto proteico ha incrementado su síntesis en las células de mamíferos (Haas y otros, Current Biology 1996, V. 6, pág. 315-324; Yang, y otros, Nucleic Acids Research 1996,

V. 24, pág. 4592-4593) . Una de dichas proteínas humanizadas es la “proteína verde fluorescente mejorada” (EGFP, por sus siglas en inglés) . Otras mutaciones en la GFP han dado lugar a versiones que emiten luz azul, cian y verde amarillo. Además, se han obtenido variantes de GFP con plegamiento mejorado y fluorescencia celular bajo incubación a 37°C. Los mutantes de GFP de A. victoria útiles se dan a conocer en detalle en las patentes de Estados Unidos 5.491.084, 5.625.048, 5.777.079, 5.804.387, 6.090.919, 5.874.304, 5.968.750, 6.020.192, 6.027.881, 6.046.925, 6.054.321, 6.066.476, 6.096.865, 6.146.826, 6.414.119, 6.638.732, 6.699.687, 6.803.188, 6.077.707, 6.124.128, 6.172.188, 6.818.443, 6.194.548, 6.265.548, 6.319.669, 6.403.374, 6.593.135, 6.800.733, 6.780.975, 6.852.849, y 6.919.186.

Se aislaron homólogos de GFP de diferentes especies, incluyendo Anthozoa y Arthropoda, (Matz y otros, Nature Biotechnol. 1999, V. 17, pág. 969-973; Shagin y otros, Mol Biol Evol. 2004, V. 21 (5) , pág. 841-850) . Un conjunto de aplicaciones biológicas y biomédicas de estas proteínas se dan a conocer en detalle por Lippincott-Schwartz y Patterson en Science, 2003, V. 300 (5616) , pág. 87-91. Además, se aislaron homólogos próximos de la GFP de A. victoria de otras medusas del género Aequorea, incluyendo la proteína verde fluorescente de A. macrodactyla, GFPxm (Xia y otros, Mar Biotechnol 2002, V. 4 (2) , pág. 155-62) y la proteína de tipo GFP de A. coerulescens, AcGFPL (Gurskaya y otros, Biochem J. (2003) , 373 (Pt 2) : 403-408) .

La GFPxm de A. macrodactyla comparte el 83% de identidad con la GFP de A. victoria. La GFPxm de tipo natural no es útil como marcador fluorescente en ensayos de base celular debido a una velocidad de maduración baja a 37°C. La modificación de GFPxm para optimizar su velocidad de maduración a temperaturas de 35-39°C proporcion a un medio para detectar el informador en células de mamífero a niveles inferiores de expresión y/o la sensibilidad incrementada en relación con la GFPxm de tipo natural. Esto mejora ampliamente la utilidad de la GFPxm en el estudio de funciones celulares en células vivas.

El documento CN 1438239 se refiere a una nueva proteína fluorescente y también da a conocer la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína, la cual mejora el polipéptido de la proteína verde fluorescente natural de medusa grande “multibarrel” para obtener la proteína fluorescente, cuyo espectro de excitación y de emisión es obviamente diferente del de la proteína natural.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

La presente invención da a conocer proteínas fluorescentes funcionales modificadas con una velocidad de maduración incrementada a una temperatura de 20ºC o superior en comparación con la proteína verde fluorescente de A. Macrodactyla (GFPxm) de tipo natural, en las que dichas proteínas fluorescentes funcionales modificadas tienen, como mínimo, el 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID 18, 20, 22, y 24 y difiere de la secuencia de aminoácidos de la proteína verde fluorescente de A. macrodactyla (GFPxm) (SEQ ID NO: 2) en una sustitución de aminoácido F220L.

En una realización preferente, la presente invención da a conocer una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína fluorescente funcional, cuya secuencia de aminoácidos es similar, de manera sustancial, a la secuencia de aminoácidos de la proteína verde fluorescente de A. Macrodactyla (GFPxm) (SEQ ID NO: 2) y difiere de la SEQ ID NO:2, como mínimo, en una sustitución de aminoácido F220L. Dicha proteína fluorescente funcional presenta una velocidad de maduración incrementada a una temperatura de 20°C o superior en comparación con la GFPxm.

Además, la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína fluorescente modificada genéticamente, cuya la secuencia de aminoácidos tiene, como mínimo, el 80% de identidad de la secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, y cuya secuencia de aminoácidos difiere de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, como mínimo, en una sustitución de aminoácido F220L, y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene, como mínimo, el 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID 18, 20, 22, y 24.

En una realización preferente, una molécula de ácido nucleico de la presente invención codifica una proteína fluorescente que también comprende sustituciones adicionales de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende K3G, E6D, T9A, P58T, F99L, F99H, M128K, M128E, I136M, Y151H, N144S, K162E, K156M, T214A, G228C, G228S, y K238R, en la que dicha proteína fluorescente funcional tiene una velocidad de maduración incrementada a una temperatura de 20°C o superior e n comparación con la GFPxm de A. macrodactyla de tipo natural.

En realizaciones preferentes, una molécula de ácido nucleico de la presente invención codifica una proteína fluorescente funcional que es similar, de manera sustancial, con la secuencia de aminoácidos de GFPxm y comprende una o más sustituciones adicionales de aminoácidos que alteran sus propiedades fluorescentes y/o optimizan el plegamiento, tal como se muestra, por ejemplo, en las SEQ ID NOs: 18-24.

En otra realización preferente, la presente invención da a conocer una proteína fluorescente funcional mutante, cuya secuencia de aminoácidos es similar, de manera sustancial, con la secuencia de aminoácidos de GFPxm de A. macrodactyla GFPxm (SEQ ID NO: 2) y que difiere de la SEQ ID NO: 2, como mínimo, en una sustitución de aminoácido F220L. Dicha proteína fluorescente funcional mutante tiene una velocidad de maduración mejorada a una temperatura de 20°C o superior en comparación c on la GFPxm. También se dan a conocer ejemplos de proteínas fluorescentes mutantes que tienen composiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende las SEQ ID NO 4-24, en los que dichas proteínas fluorescentes mutantes tienen una velocidad de maduración mejorada a una temperatura de 20°C o sup erior en comparación con la GFPxm.

En otras realizaciones, se dan a conocer vectores que comprenden un ácido nucleico de la presente invención. Además, la presente invención da a conocer un casete de expresión que comprende un ácido nucleico de la presente invención y elementos reguladores necesarios para la expresión del ácido nucleico en la célula, de manera más específica una región de inicio de la transcripción que es funcional en un huésped de expresión y una región de terminación de la transcripción funcional en dicho huésped de expresión.

De manera adicional, se dan a conocer células huésped, líneas celulares estables, animales transgénicos y plantas transgénicas que comprende ácidos nucleicos, vectores o casetes de expresión.

De manera adicional, se dan a conocer kits que comprenden ácidos... [Seguir leyendo]

1. Ácido nucleico aislado, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína fluorescente modificada genéticamente, cuya secuencia de aminoácidos tiene, como mínimo, el 80% de identidad de la secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, y cuya secuencia de aminoácidos difiere de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, como mínimo, en una sustitución de aminoácido F220L, y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene, como mínimo, el 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID 18, 20, 22, y 24.

2. Ácido nucleico, según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de la proteína fluorescente modificada genéticamente comprende además una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende K3G, E6D, T9A, P58T, F99L, F99H, M128K, M128E, I136M, Y151H, N144S, K162E, K156M, T214A, G228C, G228S, y K238R.

3. Ácido nucleico, según la reivindicación 1, en el que la proteína fluorescente modificada genéticamente tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que comprende las SEQ ID NO: 18, 20, 22, y 24.

4. Vector que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Casete de expresión, que comprende:

(a) una región de inicio de la transcripción que es funcional en un huésped de expresión;

(b) el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y

(c) una región de terminación de la transcripción funcional en dicho huésped de expresión. 25

6. Célula huésped aislada, o progenie de la misma, que comprende el casete de expresión, según la reivindicación 5, como parte de un elemento extracromosómico o incorporado en el genoma de una célula huésped como resultado de la introducción de dicho casete de expresión en dicha célula huésped.

7. Célula transgénica aislada, o progenie de la misma, que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. Proteína fluorescente modificada genéticamente, cuya secuencia de aminoácidos difiere de la SEQ ID NO: 2,

como mínimo, en la sustitución de la secuencia de aminoácido F220L, y que tiene, como mínimo, el 95% de 35 identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID 18, 20, 22, y 24.

9. Proteína fluorescente modificada genéticamente, según la reivindicación 8, en la que la proteína fluorescente modificada genéticamente comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que comprende K3G, E6D, T9A, P58T, F99L, F99H, M128K, M128E, I136M, Y151H, N144S, K162E, K156M, T214A,

G228C, G228S, y K238R.

10. Proteína fluorescente modificada genéticamente, según la reivindicación 8, en la que la proteína fluorescente modificada genéticamente tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que comprende las SEQ ID NO: 18, 20, 22, y 24.

11. Kit que comprende, como mínimo, un ácido nucleico según la reivindicación 1.