Mananasas.

Una β-mananasa modificada que se deriva de la mananasa de Trichoderma reesei de tipo silvestre mostrada enla SEQ ID NO:

1 por medio de la sustitución de al menos un residuo de aminoácido en la posición 274 con relación ala numeración de dicha mananasa de tipo silvestre por leucina (L) o metionina (M) u homólogos de los mismos, quecomprende dicha al menos una sustitución de aminoácidos de leucina (L) o metionina (M) en la posición 274 conrelación a la numeración de dicha mananasa de tipo silvestre, en donde dicha mananasa modificada, o dichoshomólogos, tienen una mayor termoestabilidad con relación a la mananasa de tipo silvestre y en donde loshomólogos tienen una identidad de secuencia de al menos 90% con la SEQ ID NO: 1.

Mananasas La presente invención proporciona una muteína de mutación de inserción, supresión y/o sustitución de º-mananasa de Trichoderma reesei de tipo silvestre que tiene mejor estabilidad térmica, estabilidad proteolítica, actividad específica y/o estabilidad a pH bajo, una molécula de ácido nucleico que codifica dicha muteína mananasa, una composición que comprende dicha muteína mananasa; un método para su preparación, y su uso para el procesamiento de alimentos y piensos, para extracción de café y el procesamiento de los residuos de café, como un suplemento para alimentos y piensos, para blanqueamiento ayudado por enzimas de pulpas de papel, como agente de blanqueamiento y/o de desencolado en la industria textil, para estimulación de un pozo de petróleo de gas por fracturamiento hidráulico, como detergente, para la remoción de biopelículas y en sistemas de suministro, o para el procesamiento de recursos renovables destinados a la producción de combustibles biológicos.

Antecedentes de la invención

Hemicelulosa y hemicelulasas: Las hemicelulosas tienen una estructura química compleja y se conocen a menudo como mananos, xilanos y galactanos sobre la base del tipo de azúcar predominante en la cadena principal. Una gama de polisacáridos tipo manano es sintetizada por medio de una amplia variedad de plantas y se encuentra en diferentes tipos de tejidos de la planta.

El papel principal de las hemicelulosas y los galactomananos es el de actuar como polisacáridos estructurales y / o como energía de reserva. Además de amilosa y amilopectina, que son los polisacáridos de almacenamiento más extendidos en las plantas, existe un grupo diverso de polisacáridos basados en manano que se encuentran en las semillas, raíces, bulbos y tubérculos de diferentes plantas. Estos incluyen mananos, galactomananos y glucomananos. Los mananos están compuestos de cadenas lineales de º-L-4-manano y se encuentran en el endospermo de las semillas de las plantas de ciertas especies de plantas. El manano ha sido aislado de tagua, dátiles o el grano de café verde. En la mayoría de los casos, los mananos son muy insolubles en agua y muy densos. En consecuencia, se ha sugerido que el manano es la base molecular para la dureza que es característica de palmiste, tales como la tagua. Los galactomananos son polisacáridos de reserva en el endospermo de las semillas de plantas de leguminosas. En contraste con los mananos no sustituidos, los galactomananos son solubles en agua y pueden almacenar agua en la semilla. Los polisacáridos pueden estar organizados en estructuras que van desde amorías irregulares hasta estructuras cristalinas altamente organizadas. El º- (1-4) -D-manano de estructura lineal ha sido encontrado por ejemplo en las paredes celulares de la tagua en dos morfologías, manano-I y manano-II, respectivamente. El primero es de morfología granular, mientras que el segundo es fibrilar.

Debido a la compleja composición estructural de la pared celular de las plantas, los microorganismos que prosperan en el material vegetal en descomposición deben poseer una cantidad de enzimas diferentes que son capaces de hidrolizar estos materiales altamente poliméricos y en su mayoría insolubles. Estos sistemas enzimáticos a menudo comprenden una combinación de enzimas que actúan en forma endo y exo. Las dos principales enzimas que actúan en forma endo involucradas en la degradación de hemicelulosas son º-mananasa y º-xilanasa. Además, las enzimas º-manosidasa, a-galactosidasa y º-glucosidasa que actúan en forma exo son necesarias para la degradación completa de galactoglucomanano. A menudo estas enzimas tienen una estructura modular en la que un dominio catalítico está conectado a través de una región de enlace a un dominio de enlazamiento de carbohidratos (CBD) (Warren (1996) Microbial hydrolysis of polysaccharides. Annu. Rev. Microbiol, 50: 183 - 212) . Sin embargo, se han encontrado otros dominios, tales como módulos de termoestabilización en algunas xilanasas.

Mananasas: La endo-º-1, 4-D-mananasa (º-mananasa, EC 3.2.1.78) cataliza la hidrólisis aleatoria de enlaces manoglicosídicos en polisacáridos a base de manano. La mayoría de las º-mananasas degradan oligosacáridos hasta DP4 (Biely y Tenkanen (1998) Enzymology of hemicellulose degradation, páginas 25 - 47. En Harman y Kubiceck (ed) Trichoderma y Gliocladium, vol.2, Taylor y Francis Ltd. Londres) , sin embargo, se ha demostrado actividad residual en manotriosa, indicando al menos cuatro subsitios de enlazamiento de manosa en la proteína. Los productos finales principales de la hidrólisis son a menudo manobiosa y manotriosa, aunque también se producen cantidades significativas de manosa. Algunas º-mananasas son capaces de degradar manano cristalino. Además de hidrólisis, en varias º-mananasas incluyendo º-mananasa de Trichoderma reesei, se ha demostrado que se forman productos de transglicosilación, ya sea con manosa o con manobiosa como aceptoras del enlace glicosídico.

Las º-mananasas han sido aisladas a partir de una amplia gama de organismos, incluyendo bacterias, hongos, plantas y animales. Aunque la mayor parte son extracelulares, algunas º-mananasas parecen estar asociadas a la célula. Su expresión a menudo se induce por medio del crecimiento sobre manano o galactomanano, sin embargo,

º-mananasa a partir de T. reesei también puede ser inducida por celulosa, mientras que su expresión es reprimida por la glucosa y otros monosacáridos. Frecuentemente múltiples mananasas con diferentes puntos isoeléctricos se encuentran en el mismo organismo, que representa productos de diferentes genes o de diferentes productos del mismo gen, respectivamente.

Trichoderma reesei produce un potente sistema de enzimas para la degradación de hemicelulasa (Biely y Tenkanen (1998) Enzimology of hemicellulose degradation, páginas 25 - 47. En Harman y Kubiceck (ed.) Trichoderma and Gliocladium, vol. 2, Taylor y Francis Ltd. Londres) , incluyendo la -mananasa Man5A, que se transcribe a partir del gen man1 (Stalbrand et al. (1995) Cloning and expression in Saccharomyces cerevisiae of a Trichoderma reesei mananasa gene containing a cellulose binding domain. Appl. Environ. Microbiol. 61: 1090 - 1097) . Las isoformas con diferentes puntos isoeléctricos se cree que representan diferentes modificaciones posteriores a la traducción tales como glicosilación. La mananasa se compone de un dominio catalítico en el terminal N y un dominio de enlazamiento de celulosa en el terminal C que se conectan a través de un enlazador O-glicosilado rico en Thr / Pro. La estructura del dominio catalítico ha sido resuelto y revela un dominio globular, que pertenece a la clase estructural de barril ( ºa) 8 (Sabini et al. (2000) The three-dimensional structure of Trichoderma reesei -mannanase from glycoside hydrolase family 5. Acta Cr y stallogr. Sect. D: Biol. Cr y stallogr. 56: 3 - 13) . Se podrían identificar una ranura que enlaza un sustrato superficial, y dos laminas adicionales que no se han conservado en otras proteínas de tipo barril ( ºa) 8.

En general, las -mananasas tienen una temperatura óptima moderada entre 40º C y 70º C, excepto algunas mananasas de termófilos (Politz et al. (2000) A highly thermostable endo-1, 4--mannanase from the marine bacterium Rhodothermus marinus; Appl. Microbiol. Biotechnol. 53: 715 - 721) . El pH optimo está en la región neutra o ácida, por ejemplo un pH 5, 0 para -mannanase de T. reesei (Arisan-Atac et al. (1993) Purification and characterisation of a -mannanase of Trichoderma reesei C-30; Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 58 - 62) . Los pesos moleculares de las enzimas están en el rango entre 30 kD y 80 kD.

El documento WO 03/012110 divulga, entre otros, una secuencia de aminoácidos de mananasa del organismo del hongo Hypocrea jecorina, que es un sinónimo de Trichoderma reesei.

Estabilidad de la enzima: La estabilidad (incluida termoestabilidad, estabilidad frente al pH y estabilidad frente a la digestión proteolítica) y la actividad bajo condiciones de aplicación es un parámetro crítico para muchas enzimas aplicadas industrialmente, ya que estas enzimas a menudo tienden a ser insuficientemente estables o insuficientemente activas bajo condiciones de aplicación. Por ejemplo, una alta termoestabilidad permite una dosificación más baja de la enzima debido a una actividad más prolongada bajo condiciones de proceso de alta temperatura y por lo tanto proporciona una ventaja comercial. Muchos organismos mesófilos y termófilos expresan variantes de la enzima que se adaptan a las respectivas condiciones de temperatura en las cuales los organismos se desarrollan. Mientras que las especies mesófilas tienden a tener menos enzimas termoestables, los organismos termófilos deben poseer enzimas muy estables.... [Seguir leyendo]

1. Una -mananasa modificada que se deriva de la mananasa de Trichoderma reesei de tipo silvestre mostrada en la SEQ ID NO: 1 por medio de la sustitución de al menos un residuo de aminoácido en la posición 274 con relación a la numeración de dicha mananasa de tipo silvestre por leucina (L) o metionina (M) u homólogos de los mismos, que comprende dicha al menos una sustitución de aminoácidos de leucina (L) o metionina (M) en la posición 274 con relación a la numeración de dicha mananasa de tipo silvestre, en donde dicha mananasa modificada, o dichos homólogos, tienen una mayor termoestabilidad con relación a la mananasa de tipo silvestre y en donde los homólogos tienen una identidad de secuencia de al menos 90% con la SEQ ID NO: 1.

2. La mananasa modificada de la reivindicación 1, en donde el residuo en la posición 274 se sustituye por leucina (L) y que comprende además una sustitución en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste de

- L207F,

- T201 S, Q280R,

- A215T; N282D,

- Y220F,

- V187M,

-V181A,

-V148I,

- N173H; N331S,

- N13D,

- Q317H,

- F4Y; I70V,

- Q101R; Q281H,

- T201 G; L207F,

- T201 S; L207F,

- V181T; L207W; A215T,

- K74M; A313T; V325I,

- N173H; V181H; L207W,

- T201S; L207Y; Q280R,

- T201S; L207W; Q280R,

- T201S; L207R; Q280R,

- N173H; L207W,

- 215T; Q280R,

- V181H; L207W,

- A215T; N282D,

- N173H; V181T; T201S; L207W,

- N173H; V181H; L207W; A215T,

- V181H; L207W,

- A215T; Q280R; N282D,

- N173H; V181T; L207W; A215T; Q280R; N282D.

3. La mananasa modificada de la reivindicación 1, en donde

(i) la sustitución se localiza en la segunda mitad de la molécula y los cambios se presentan en una posición de 200 o superior, de acuerdo con la numeración de la mananasa de tipo silvestre dada en la SEQ ID NO: 1; y/o

(ii) el número de sustituciones es de 2 a 30, de 2 a 10, y/o de 2 a 5.

4. Una molécula de ácido nucleico, que codifica la mananasa modificada de acuerdo con la reivindicación 1.

5. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4.

6. Una célula huésped que es transformada con el vector de la reivindicación 5 y/o que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5.

7. Un método para preparar la mananasa modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 6, y el aislamiento de la mananasa modificada del cultivo.

8. Una composición que comprende la mananasa modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a

3.

9. La composición de la reivindicación 8, que es adecuada para el procesamiento de alimentos y de piensos, como suplemento para alimentos y piensos, para blanqueamiento asistido por enzimas de pulpas de papel, para estimulación de pozos de petróleo y de gas fracturamiento hidráulico, para la remoción de biopelículas, o en sistemas de suministro.

10. El uso de una mananasa modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3

• para el procesamiento de alimentos y piensos,

• para extracción de café,

• para el procesamiento de residuos de café,

• como un suplemento para alimentos piensos,

• para blanqueamiento asistido por enzimas de pulpas de papel,

• como agente de blanqueamiento y/o de desencolado en la industria textil,

• para estimulación de pozos de petróleo y de gas por fracturamiento hidráulico,

• como detergente,

• para la remoción de biopelículas,

• en sistemas de suministro, y/o

• para el procesamiento de recursos renovables destinados a la producción de combustibles biológicos.