Proteínas utilizadas para el diagnóstico de una borreliosis de Lyme.

Proteína quimérica de Borrelia que comprende al menos una secuencia del dominio extracelular de unaproteína VlsE de una primera especie de Borrelia que corresponde a una cepa determinada y al menos unasecuencia de una región IR6 de una proteína VlsE de una segunda especie de Borrelia o de la primera especie deBorrelia pero que corresponde a una cepa diferente de la de la primera especie,

comprendiendo dicha proteínaquimérica:

- la secuencia del dominio extracelular de la proteína VlsE de la primera especie de Borrelia que está compuesta deregiones variables VR1, VR2, VR3, VR4 y VR5, y de 6 regiones invariables IR1, IR2, IR3, IR4, IR5 y IR6, y dicha almenos una secuencia del dominio extracelular se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 y5, o una variante de una de dichas secuencias SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 y 5, presentando dicha variante una identidadde al menos 50% con las SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 y 5, respectivamente, con la condición de que dicha variante seacapaz de formar un inmunocomplejo con los anticuerpos producidos después de una infección por Borrelia, y

- la al menos una secuencia de la región IR6 de la segunda especie de Borrelia o de la primera especie de Borreliapero que corresponde a una cepa diferente de la de la primera especie, se selecciona del grupo que consiste en lasSEQ ID NO: 6, 7 y 8 o una variante de una de dichas secuencias SEQ ID NO 6, 7 y 8, presentando dicha varianteuna identidad de al menos 80% con las SEQ ID NO 6, 7 y 8, respectivamente, con la condición de que la variante dedicha secuencia sea capaz de formar un inmunocomplejo con los anticuerpos producidos después de una infecciónpor Borrelia.

Proteínas utilizadas para el diagnóstico de una borreliosis de Lyme La borreliosis de Lyme (LB) es una enfermedad infecciosa no contagiosa, debida a una espiroqueta llamada Borrelia burgdorferi, transmitida al hombre por una picadura de la garrapata del género Ixodes. La LB, sin tratamiento, conduce a diversos problemas patológicos (dermatológicos, artríticos, cardiacos, neurológicos y a veces oculares) . Es la enfermedad transmitida por vector más común en los EE.UU. y en algunos países templados del hemisferio norte.

Varias especies de Borrelia, actualmente denominadas con el término de grupo burgdorferi o Borrelia burgdorferi en sentido amplio (que incluyen Borrelia burgdorferi en sentido estricto, B. garinii y B. afzelii) están implicadas en esta infección. Estas especies son patógenas para el hombre.

En Estados Unidos, la especie infecciosa implicada es Borrelia burgdorferi en sentido estricto. En Europa a esta especie se le añaden B. garinii y B. afzelii. En Asia, las especies implicadas son B. garinii y B. afzelii.

En estados Unidos hay declarados alrededor de 10.000 casos. En Europa las tasas de incidencia varían en menos de 5 por 100.000.

La borreliosis de Lyme evoluciona pasando por tres fases distintas, de la infección precoz a la fase tardía. La fase precoz (fase I) puede ser asintomática o traducirse en un cuadro pseudogripal. En el 50-80% de los casos se observa la aparición de una erupción cutánea inflamatoria, varios días después de la picadura de la garrapata, de aspecto muy particular, llamada eritema migratorio (EM) . En ausencia de tratamiento, la diseminación de Borrelia por vía sanguínea se traduce varias semanas después en artritis inflamatorias sobrevenidas, afecciones neurológicas (neuroborreliosis) y meníngeas, manifestaciones cutáneas y cardiacas (fase II) . Después de varios meses o años, la enfermedad evoluciona hacia una forma crónica atrófica, encefalopatía, encefalomielitis y artritis crónica (fase III) .

Existe un tropismo orgánico particular de cada una de las especies de Borrelia burgdorferi. Si la primera fase de eritema migratorio está ligada indistintamente a las tres especies, la evolución hacia una forma neurológica está asociada de forma preferente a la especie B. garinii, las artritis más bien a B. burgdorferi en sentido estricto, y la acrodermatitis crónica atrófica es específica de B. afzelii.

La similitud de los síntomas clínicos de la borreliosis de Lyme y de otras enfermedades no relacionadas, así como la variabilidad de las manifestaciones, hacen difícil el diagnóstico clínico. El diagnóstico de la borreliosis puede ser particularmente difícil basándose en las observaciones clínicas, si están ausentes las pruebas de anamnesis (picadura de garrapata o EM) . La fase precoz de la enfermedad puede no ser aparente hasta el momento en el que alcanza las fases clínicas más avanzadas.

Debido a esto, el diagnóstico de la LB se basa en signos clínicos y también en la detección de los anticuerpos específicos de patógenos de Borrelia burgdorferi en el suero, con más frecuencia por ELISA (ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas) o también EIA, IFA.

En Europa la evaluación de la respuesta serológica es complicada debido a la existencia de tres especies patógenas y a la variabilidad entre especies para los antígenos inmunodominantes principales. Los antígenos usados actualmente de forma rutinaria para la detección de las IgG e IgM de LB son de muestras celulares de Borrelia burgdorferi en sentido amplio tratadas con ultrasonidos. Los resultados de los ensayos serológicos con estos antígenos en términos de especificidad y de sensibilidad son muy variables. Así pues, debido a una especificidad insuficiente, que implica reactividades cruzadas con anticuerpos asociados a bacterias patógenas, en particular Treponema pallidum (agente etiológico de la sífilis) , garrapatas, rickettisies, erlichia o Helicobacter pylori, el diagnóstico de las muestras positivas ensayadas por ELISA debe confirmarse por inmunotransferencia. La sensibilidad también es un factor principal. En efecto, Borrelia burgdorferi en sentido amplio expresa diferentes proteínas de superficie por adaptación a diversos microentornos, de modo que la diversidad genética y la expresión diferencial de los genes de Borrelia burgdorferi en los pacientes tienen implicaciones importantes para el desarrollo de los ensayos serológicos de LB.

Por lo tanto, era necesario desarrollar un kit que palie los inconvenientes citados antes y que más en particular responda a los criterios de especificidad y de sensibilidad esperados.

La proteína VlsE (surface expressed lipoprotein with Extensive antigenic Variation) es expresada principalmente in vivo, de forma transitoria y rápidamente después de infección del hospedante. Es muy inmunogénica en el hospedante infectado, implicando la producción de IgG e IgM. El locus de Vls está localizado en un plásmido lineal de 28 kb (Ip28-1) presente en las tres genoespecies de borrelia responsables de Lyme y compuesto de casetes silenciosos y de un sitio de expresión (VlsE) . In vivo, se producen recombinaciones aleatorias entre casetes de expresión y casetes silenciosos en el transcurso de la infección y son el origen de la variabilidad antigénica de VlsE. La proteína VlsE está compuesta de seis regiones variables VR1-VR6, situadas en la superficie de la proteína VlsE, espaciadas por regiones invariables IR1-IR6.

Es conocido que las proteínas VlsE presentan una heterogeneidad importante inter e intraespecies. En 2004, Göttner et al. [1] describieron una identidad de aproximadamente 47 a 58% a nivel proteico de VlsE procedente de cuatro cepas.

El documento US2009/0162875 describe proteínas quiméricas que comprenden la región IR6 de VlsE para el diagnóstico de una borreliosis.

Para paliar los problemas de sensibilidad y especificidad citados antes, los autores de la invención han producido una proteína quimérica de Borrelia que comprende al menos una secuencia del dominio extracelular de una proteína VlsE de una primera especie de Borrelia que corresponde a una cepa determinada y al menos una secuencia de una región IR6 de una proteína VlsE de una segunda especie de Borrelia o de la primera especie de Borrelia pero que corresponde a una cepa diferente de la de la primera especie, comprendiendo dicha proteína quimérica (o que consiste esencialmente en o incluso que consiste en) :

-la secuencia del dominio extracelular de la proteína VlsE de la primera especie de Borrelia que está compuesta de 5 regiones variables VR1, VR2, VR3, VR4 y VR5, y de 6 regiones invariables IR1, IR2, IR3, IR4, IR5 y IR6, seleccionándose dicha al menos una secuencia del dominio extracelular del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 y 5, o una variante de una de dichas secuencias SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 y 5, presentando dicha variante una identidad de al menos 50% (preferiblemente identidad de al menos 60% o al menos 70% y ventajosamente una identidad de al menos 80% o al menos 85%) con las SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 y 5, respectivamente, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un inmunocomplejo con los anticuerpos producidos después de una infección por Borrelia, y

-la al menos una secuencia de la región IR6 de la segunda especie de Borrelia o de la primera especie de Borrelia pero que corresponde a una cepa diferente de la de la primera especie, se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 7 y 8 o una variante de una de dichas secuencias de SEQ ID NO 6, 7 y 8, presentando dicha variante una identidad de al menos 80% (preferiblemente una identidad de al menos 85% y ventajosamente de al menos 90%) con las SEQ ID NO 6, 7 y 8, respectivamente, con la condición de que la variante de dicha secuencia sea capaz de formar un inmunocomplejo con los anticuerpos producidos después de una infección por Borrelia.

La proteína quimérica identificada más arriba puede comprender además una secuencia variable VR6 de una especie de Borrelia, identificándose esta secuencia en la SEQ ID NO: 9 en la lista de secuencias.

Una proteína quimérica preferida comprende (o consiste esencialmente en o consiste en) :

-la secuencia SEQ ID NO: 1 o una variante de dicha secuencia SEQ ID NO: 1, presentando dicha variante una identidad de al menos 50% (preferiblemente una identidad de al menos 60% o al menos 70% y ventajosamente una identidad de al menos 80% o al menos 85%) con la SEQ ID NO: 1,

-la secuencia SEQ ID NO: 6 o una variante de dicha secuencia SEQ ID NO: 6, presentando dicha variante una identidad de al menos 80% (preferiblemente de al menos 85% y ventajosamente una identidad de al menos 90%) con la SEQ ID NO: 6,

-la secuencia... [Seguir leyendo]

1. Proteína quimérica de Borrelia que comprende al menos una secuencia del dominio extracelular de una proteína VlsE de una primera especie de Borrelia que corresponde a una cepa determinada y al menos una secuencia de una región IR6 de una proteína VlsE de una segunda especie de Borrelia o de la primera especie de Borrelia pero que corresponde a una cepa diferente de la de la primera especie, comprendiendo dicha proteína quimérica:

-la secuencia del dominio extracelular de la proteína VlsE de la primera especie de Borrelia que está compuesta de 5 regiones variables VR1, VR2, VR3, VR4 y VR5, y de 6 regiones invariables IR1, IR2, IR3, IR4, IR5 y IR6, y dicha al menos una secuencia del dominio extracelular se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 y 5, o una variante de una de dichas secuencias SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 y 5, presentando dicha variante una identidad de al menos 50% con las SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 y 5, respectivamente, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un inmunocomplejo con los anticuerpos producidos después de una infección por Borrelia, y

-la al menos una secuencia de la región IR6 de la segunda especie de Borrelia o de la primera especie de Borrelia pero que corresponde a una cepa diferente de la de la primera especie, se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 7 y 8 o una variante de una de dichas secuencias SEQ ID NO 6, 7 y 8, presentando dicha variante una identidad de al menos 80% con las SEQ ID NO 6, 7 y 8, respectivamente, con la condición de que la variante de dicha secuencia sea capaz de formar un inmunocomplejo con los anticuerpos producidos después de una infección por Borrelia.

2. Proteína según la reivindicación 1, que además comprende una secuencia VR6 de una especie de Borrelia identificada en la SEQ ID NO: 9.

3. Proteína según la reivindicación 1, que comprende:

-la secuencia SEQ ID NO: 1 o una variante de dicha secuencia SEQ ID NO: 1, presentando dicha variante una identidad de al menos 50% con la SEQ ID NO: 1,

-la secuencia SEQ ID NO: 6 o una variante de dicha secuencia SEQ ID NO: 6, presentando dicha variante una identidad de al menos 80% con la SEQ ID NO: 6,

-la secuencia SEQ ID NO: 7 o una variante de dicha secuencia SEQ ID NO: 7, presentando dicha variante una identidad de al menos 80% con la SEQ ID NO: 7, y

-la secuencia SEQ ID NO: 8 o una variante de dicha secuencia SEQ ID NO: 8, presentando dicha variante una identidad de al menos 80% con la SEQ ID NO: 8.

4. Proteína según la reivindicación 3, que comprende además la secuencia SEQ ID NO: 9.

5. Proteína según la reivindicación 3, que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1, la secuencia SEQ ID NO: 6, la secuencia SEQ ID NO: 7 y la secuencia SEQ ID NO: 8.

6. Proteína según la reivindicación 5, que comprende la secuencia SEQ ID NO: 9.

7. Proteína según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 23.

8. Ácido nucleico que codifica una proteína tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Casete de expresión que está funcionalmente en una célula derivada de un organismo procariota o eucariota, que permite la expresión de un ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 8, situado bajo el control de los elementos necesarios para su expresión.

10. Vector que comprende un casete de expresión, tal como se define en la reivindicación 9.

11. Procedimiento para el diagnóstico in vitro de una borreliosis de Lyme en una muestra biológica, según el cual se pone en contacto la muestra biológica con al menos una proteína tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y se determina si hay formación de un inmunocomplejo entre dicha proteína y los anticuerpos de la muestra biológica.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que los anticuerpos de la muestra biológica son IgG y/o IgM.

13. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la formación del complejo inmunológico está determinada por la adición de al menos una anti-inmunoglobulina humana marcada con cualquier marcador adecuado.

14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que la proteína está inmovilizada sobre un soporte sólido.

15. Kit para el diagnóstico in vitro de una borreliosis de Lyme, que comprende al menos una proteína como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

16. Kit según la reivindicación 15, que comprende al menos una anti-inmunoglobulina humana marcada con cualquier marcador adecuado.