Proteínas de Streptococcus inmunogénicas.

Un método para identificar una proteína de Streptococcus uberis que es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas y/o serotipos de de Streptococcus uberis,

comprendiendo dicho método:

a) identificar al menos parte de:

- una proteína segregada y/o

- una proteína asociada a la superficie y/o

- una proteína con al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:156, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:174, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:180, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:188 y SEQ ID NO:190;

b) seleccionar al menos una proteína identificada en la etapa a) que se conserva a través de al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis; y

c) ensayar si al menos una proteína seleccionada en la etapa b) o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de esta, es capaz de unirse específicamente a un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una primera cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis, y un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una segunda cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis.

Proteínas de Streptococcus inmunogénicas.

La invención se refiere al campo de la medicina. Más concretamente, la invención se refiere a proteínas de Streptococcus inmunogénicas y a sus partes, derivados y análogos inmunogénicos.

El género Streptococcus está formado por una amplia variedad de bacterias Gram-positivas patógenas y comensales que viven en una amplia gama de hospedantes, incluyendo seres humanos, caballos, cerdos y vacas. Dentro del hospedante, los estreptococos a menudo colonizan las superficies mucosas del tracto respiratorio superior. Sin embargo, en ciertas circunstancias, los estreptococos también pueden provocar enfermedades que varían de subagudas a agudas o incluso crónicas.

Hasta la fecha, muchas vacunas comerciales contra Streptococcus se basan en bacterinas de células completas. En general, dichas bacterinas producen una significativa protección frente a la exposición a serotipos homólogos, pero no protegen frente a la exposición a serotipos heterólogos. La vacunación con Streptococcus de células completas a menudo produce una respuesta inmunológica que se dirige contra la misma cepa de Streptotoccus, pero que no se dirige (suficientemente) contra otras cepas de Streptococcus, ni mucho menos contra otros serotipos de Streptococcus. Como resultado, muchas vacunas proporcionan insuficiente protección frente a cepas y/o serotipos heterólogos, porque la vacunación contra una cepa de Streptococcus en general no es eficaz para contrarrestar la infección por otra cepa de Streptococcus. Además, la vacunación contra un serotipo de Streptococcus en general no es eficaz para contrarrestar la infección por otro serotipo de Streptococcus. Por tanto, se desean composiciones inmunogénicas capaces de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas de Streptococcus, preferiblemente contra dos serotipos de Streptococcus.

El documento WO 00/37105, y Zhang et al., Infection and Immunity, 74 (2006) , 4200-4213, describen métodos para identificar proteínas de Streptococcus capaces de provocar respuestas inmunológicas. Groschup et al., Epidemiol. Infect., 107 (1991) , 297-310, describen antígenos de S. uberis. Almeida et al., Vet. Microbiology, 115 (2006) , 183191, y el documento WO 2004/048515, describen la identificación de la molécula de adhesión de Streptococcus uberis (SUAM) .

Un objeto de la presente descripción es proporcionar proteínas Streptococcus, y sus partes inmunogénicas, derivados y/o análogos, y moléculas de ácidos nucleicos que los codifican, que son capaces de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas de Streptococcus uberis.

La invención proporciona un método para identificar una proteína de Streptococcus uberis que es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas de de Streptococcus uberis, comprendiendo dicho método:

a) identificar al menos parte de una proteína segregada, una proteína asociada a la superficie y/o una proteína con al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína listada en la figura 4;

b) seleccionar al menos una proteína identificada en la etapa a) que se conserva a través de al menos dos cepas de Streptococcus uberis; y

c) ensayar si al menos una proteína seleccionada en la etapa b) o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de esta, es capaz de unirse específicamente a un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una primera cepa de Streptococcus uberis, y un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una segunda cepa de Streptococcus uberis.

Según la presente invención, se identifica al menos una proteína de Streptococcus uberis que es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas de Streptococcus uberis. Dicha proteína es adecuada para inmunizar a un individuo y/o un animal no humano porque es capaz de provocar una respuesta inmunológica amplia. Por tanto, la presente invención obvia la necesidad de proporcionar una vacuna para cada una de las cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis. Por tanto, el uso de una proteína inmunogénica de Streptococcus uberis de la invención ahorra tiempo y dinero. De modo más importante, una proteína inmunogénica de Streptococcus uberis de la invención es capaz, en principio, de provocar una respuesta inmunológica contra una cepa de Streptococcus uberis que aún no sea conocida, o contra la que aún no existe una vacuna específica disponible (por ejemplo, una cepa que haya evolucionado recientemente en la naturaleza) . Preferiblemente, una proteína de Streptococcus uberis de la invención es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos serotipos de Streptococcus uberis. Una realización preferida de la invención, por tanto, proporciona un método para identificar una proteína de Streptococcus uberis que es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos serotipos de Streptococcus uberis, comprendiendo dicho método:

a) identificar al menos parte de una proteína segregada, una proteína asociada a la superficie y/o una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína listada en la figura 4;

b) seleccionar al menos una proteína identificada en la etapa a) que se conserva a través de al menos dos cepas de Streptococcus uberis; y

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c) ensayar si al menos una proteína seleccionada en la etapa b) o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de esta, es capaz de unirse específicamente a un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por un primer serotipo de Streptococcus uberis, y un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por un segundo serotipo de Streptococcus uberis.

En la presente se define una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas de Streptococcus uberis y/o serotipos de Streptococcus uberis como una respuesta inmunológica humoral y/o celular dirigida contra Streptococcus uberis de al menos dos cepas y/o serotipos diferentes. Dicha respuesta inmunológica se provoca, por ejemplo, en un animal no humano. También es posible provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis en un individuo humano para prevenir y/o contrarrestar una enfermedad relacionada con Streptococcus uberis. Una respuesta inmunológica humoral conduce a la producción de anticuerpos, mientras que una respuesta inmunológica celular potencia predominantemente la formación de células inmunológicas reactivas, tales como células T asesinas. En general, ambas partes de la respuesta inmunológica son provocadas por la administración de una proteína inmunogénica o una parte inmunogénica de esta. Una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas/serotipos de Streptococcus uberis comprende preferiblemente la producción de anticuerpos. Dicha respuesta inmunológica es preferiblemente capaz de disminuir, al menos en parte, el número de organismos de Streptococcus uberis en un individuo humano y/o un animal no humano. Además, dicha respuesta inmunológica preferiblemente es capaz de contrarrestar, al menos en parte, un trastorno provocado por Streptococcus uberis.

Una cepa de Streptococcus uberis puede identificarse mediante sus características morfológicas, bioquímicas y serológicas, tal como se conoce en la técnica. Un serotipo de Streptococcus uberis es un grupo de Streptococcus uberis cuya clasificación se basa en la presencia de polisacáridos antigénicos específicos. La clasificación de los serotipos de Streptococcus uberis también es muy conocida en la técnica.

Un método de la invención comprende identificar al menos parte de una proteína segregada, una proteína asociada a la superficie y/o una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína listada en la figura 4. Dicha proteína se identifica de diversos modos. En una realización de la invención se emplea una estrategia genómica. Se identifica un gen que codifica una proteína segregada y/o una proteína asociada a la superficie, por ejemplo, buscando un motivo de dicha proteína segregada y/o proteína asociada a la superficie. Dicho motivo comprende preferiblemente un sitio de unión a lípidos, un sitio de ruptura de peptidasas señal y/o un sitio de unión de sortasa. Por supuesto, es posible buscar otros motivos conocidos en la técnica. Por tanto, una realización de la invención proporciona un método de la invención, en el que dicha proteína segregada y/o proteína asociada a la superficie se identifica identificando, en al menos parte de la secuencia genómica de Streptococcus uberis, un gen que comprende un motivo de una proteína segregada y/o asociada a la superficie.

Además, o como... [Seguir leyendo]

1. Un método para identificar una proteína de Streptococcus uberis que es capaz de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas y/o serotipos de de Streptococcus uberis, comprendiendo dicho método:

a) identificar al menos parte de:

- una proteína segregada y/o

- una proteína asociada a la superficie y/o

- una proteína con al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:156, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:174, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:180, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:188 y SEQ ID NO:190;

b) seleccionar al menos una proteína identificada en la etapa a) que se conserva a través de al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis; y

c) ensayar si al menos una proteína seleccionada en la etapa b) o una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de esta, es capaz de unirse específicamente a un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una primera cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis, y un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una segunda cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que dicha proteína segregada y/o proteína asociada a la superficie se identifica identificando, en al menos parte de la secuencia genómica de Streptococcus uberis, un gen que comprende un motivo de una proteína segregada y/o asociada a la superficie.

3. Un método según la reivindicación 1 o 2, en el que dicha proteína con al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:156, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:174, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:180, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:188 y SEQ ID NO:190 se identifica identificando, en al menos parte de la secuencia genómica de Streptococcus uberis, un gen con al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:163, SEQ ID NO:165, SEQ ID NO:167, SEQ ID NO:169, SEQ ID NO:171, SEQ ID NO:173, SEQ ID NO:175, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:179, SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:185, SEQ ID NO:187 y SEQ ID NO:189.

4. Un método según la reivindicación 1 o 2 o 3, en el que dicha proteína con al menos 80% de identidad de secuencia con una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:156, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:174, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:180, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:188 y SEQ ID NO:190 se identifica identificando, en al menos parte de la secuencia genómica de Streptococcus uberis, un gen que se hibrida con la secuencia de nucleótidos de longitud completa de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:163, SEQ ID NO:165, SEQ ID NO:167, SEQ ID NO:169, SEQ ID NO:171, SEQ ID NO:173, SEQ ID NO:175, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:179, SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:185, SEQ ID NO:187 y SEQ ID NO:189 a 65 ºC en un

tampón que tiene fosfato de sodio 0, 5 M, EDTA 1 mM, y dodecilsulfato de sodio al 7% a un pH de 7, 2, en el que la molécula de ácido nucleico permanece hibridada después de: -lavar dos veces con un tampón que contiene fosfato de sodio 40 mM (pH 7, 2) , EDTA 1 mM y dodecilsulfato de

sodio al 5% durante 30 minutos a 65 ºC, y;

-lavar dos veces con un tampón que contiene fosfato de sodio 40 mM (pH 7, 2) , EDTA 1 mM y dodecilsulfato de sodio al 1% durante 30 minutos a 65 ºC.

5. Un método según la reivindicación 2, 3 o 4, que comprende además seleccionar un gen que se conserva a través de al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis.

6. Un método según la reivindicación 5, que comprende además obtener una proteína codificada por dicho gen, o 10 una parte inmunogénica, un derivado y/o un análogo de dicha proteína.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en el que dicho gen se expresa en un sistema de expresión procariota. 8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende: - obtener proteínas de Streptococcus uberis aisladas y/o recombinantes;

- incubar dichas proteínas con un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una primera cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis, y con un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por una segunda cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis, y

- ensayar si una proteína es capaz de unirse a un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal infectado por

una primera cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis, y un anticuerpo y/o una célula inmunológica de un animal 20 infectado por una segunda cepa y/o serotipo de Streptococcus uberis.

9. Un método según la reivindicación 8, que comprende además expresar dicha proteína utilizando una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteína.

10. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicho anticuerpo y/o célula inmunológica se deriva de un suero convaleciente.

11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que dicha proteína de Streptococcus uberis es capaz de suscitar anticuerpos inductores de la opsonofagocitosis.

12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que se identifican al menos dos proteínas de Streptococcus uberis capaces de provocar una respuesta inmunológica contra al menos dos cepas y/o serotipos de Streptococcus uberis.

Figura 4. Secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos de las proteínas de S. uberis de la tabla 5.

62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87