Procedimiento para proporcionar una preparación de anticuerpos purificada y viralmente segura.

Un procedimiento para preparar una preparación de anticuerpos purificada,

viralmente inactivada y viralmentesegura, a partir de una disolución de partida que comprende anticuerpos y contaminantes, comprendiendo elprocedimiento las etapas de:

(a) ajustar el pH de la disolución de partida a un valor entre 4,6 y 4,95, en particular a un valor entre 4,8 y 4,95,para producir una disolución intermedia;

(b) añadir iones caprilato y/o heptanoato a la disolución intermedia y mantener el pH entre 4,8 y 4,95, con lo quese forma un precipitado y los anticuerpos están esencialmente presentes en el sobrenadante;

(c) incubar la disolución sobrenadante tras una segunda adición de iones caprilato y/o heptanoato en las mismascondiciones que en la etapa b), realizar la filtración de la disolución resultante y opcionalmente concentrar ydiafiltrar la disolución filtrada antes de ajustar el pH;

(d) aplicar la disolución filtrada a, al menos, una resina de intercambio de aniones a un pH de entre 5,0 y 5,2 y,opcionalmente, con dos resinas de intercambio de aniones diferentes, que une los contaminantes a la resina y almismo tiempo no permite la unión de los anticuerpos a la resina, en el que se produce una preparación deanticuerpos purificada, viralmente inactivada y viralmente segura.

Procedimiento para proporcionar una preparación de anticuerpos purificada y viralmente segura La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar una preparación de anticuerpos purificada, viralmente segura, a partir de una disolución de partida que comprende anticuerpos y contaminantes. Describe un procedimiento de purificación de las gamma globulinas del plasma humano y de otras fuentes. Las etapas de inactivación y eliminación de virus se incluyen en el procedimiento de fabricación que se describe en el presente documento.

Precipitación y eliminación/inactivación viral resultante En la década de los años 40, Cohn y col. introdujeron el fraccionamiento del plasma humano con etanol frío. Diversas variaciones de este esquema surgieron para aumentar la pureza y/o el rendimiento de los diferentes productos intermedios. En el fraccionamiento de Cohn se identificaron algunas etapas para contribuir eficazmente a la inactivación y eliminación viral. En el procedimiento de IgG en especial, la separación de la fracción I+III de Cohn es muy eficaz a este respecto. Algunos virus sensibles (principalmente los virus con envoltura) son destruidos por el pH bajo y la presencia de EtOH y una gran parte de los virus con envoltura y sin envoltura se eliminan mediante la separación en el precipitado I+III, que por lo general se desecha.

En la década de los años 60, se mostró que los ácidos grasos de cadena corta (C6-C12) forman complejos insolubles con α-y β-globulinas, mientras que las γ-globulinas no precipitan con tanta facilidad (Chanutin y col., 1960) . Steinbruch y col. (1996) describieron un procedimiento de purificación para IgG con caprilato (es decir, octanoato, un ácido graso saturado de 8 átomos de carbono) como agente de precipitación. Se precipitaron componentes del plasma humano diferentes de inmunoglobulinas después de la dilución con un tampón de acetato para alcanzar un pH final de 4, 8. Después de la adición de caprilato con agitación vigorosa se obtuvo una disolución enriquecida en IgG. La pureza y el rendimiento dependían de la cantidad de ácido caprílico, del pH, de la molaridad del tampón y del factor de dilución. Steinbruch y col. también afirmaron que es ventajoso añadir la cantidad efectiva de caprilato en dos etapas con la eliminación de los precipitados entre medio. Los virus sin envoltura y con envoltura se eliminan mediante separación en el precipitado de las proteínas no IgG como es el caso de la separación de la fracción I+III.

Cromatografía Varias patentes describen la purificación de una disolución de IgG en el así llamado modo negativo; la IgG atraviesa sin unirse (sólo en trazas) , mientras que la mayoría de las proteínas de la fracción no IgG se unen a los ligandos aniónicos (Bertolini y col. 1998, documento WO-A-98/05686; Lebing 1999, documento US-A-5.886.154; Friesen y col., 1986, documento CA 1.201.063) . La combinación de la precipitación con caprilato seguida por cromatografía de intercambio iónico para la purificación de IgG se describió en muchas publicaciones. Una de las primeras fue escrita por Steinbuch y col. (1969) . En ella se describe la purificación adicional de IgG después de la precipitación de caprilato con DEAE-celulosa. La reciente publicación por Lebing y col. (2003) describe dos columnas de intercambio aniónico usadas en serie para la eliminación de IgM, IgA, albúmina y otras impurezas. Lebing y col. combinaron ambos efectos mediados por el caprilato, a saber, la reducción esencial de la cantidad de proteínas no IgG por precipitación, utilizando de ese modo la separación de virus, y las propiedades de inactivación de los virus con envoltura del ácido graso en una etapa de incubación independiente. Se destaca la importancia esencial de la así llamada “oscilación de pH” de Lebing y col. (2003) , a partir de la reconstitución de una pasta/precipitado que contiene IgG a pH 4, 2 y la posterior adición de caprilato tras ajustar el pH a 5, 2 para el procedimiento de enriquecimiento de IgG, por lo tanto es necesaria para reducir de forma eficaz la cantidad las proteínas no IgG. La cantidad de algunas otras impurezas, tales como IgA e IgM, así como el caprilato se redujo posteriormente por medio de las etapas de cromatografía de intercambio iónico mencionadas.

Sorprendentemente, los inventores encontraron que tal cambio de pH como el que se describe anteriormente y que está descrito por Lebing y col. no es necesario para lograr un efecto de purificación significativa tras la adición caprilato y la eliminación del precipitado resultante. En su lugar, si se mantiene constante el pH a un pH de 4, 6 a 4, 95 durante todo el procedimiento de reconstitución de la pasta, la incubación con caprilato y la eliminación del precipitado, se consigue un enriquecimiento de IgG eficaz. También se reduce la cantidad de impurezas, especialmente albúmina, de manera más eficiente, si se mantiene el pH constante en el intervalo de 4, 8 a 4, 95. Al mismo tiempo, se eliminan los virus. Posteriormente se separan las impurezas residuales y el caprilato por medio de las etapas de intercambio iónico.

Inactivación clásica de virus Los tratamientos con disolvente y detergente y pH 4 son procedimientos muy conocidos y ampliamente utilizados para las inmunoglobulinas. El tratamiento con disolvente y detergente (SD, por su sigla en inglés) se introduce normalmente en estos procedimientos debido a su superioridad en términos de inactivación de los virus con envoltura (Biesert L. Clinical and Experimental Rheumatology 1996; 14: 47) . Tanto los virus con envoltura como los sin envoltura se ven afectados por la exposición a pH bajo, aunque los virus con envoltura se ven más afectados que los que no tienen envoltura (Biesert. Clinical and Experimental Rheumatology 1996, 14: 47, Bos y col. Biologicals 1998; 26: 267, In Seop y col. J Microbiol Biotechnol 2001; 11: 619) .

En el documento EP-A-0 525 502 se describen la combinación de tratamiento con disolvente y detergente y la incubación a pH 4 como etapas de inactivación de virus.

Filtración de virus Las disoluciones de IgG se filtran a través de membranas de tamaño de poro muy pequeño (normalmente de 15 a 50 nm) en condiciones que retienen los virus por un mecanismo basado en gran medida en la exclusión por tamaños (Burnouf and Radosevich. Haemophilia 2003; 9: 24) para aumentar la seguridad viral. Para la filtración de las inmunoglobulinas también se utilizan los filtros de profundidad diseñados para retener los virus por adsorción de intercambio iónico.

Sumario de la invención La invención describe un procedimiento de purificación de IgG con un mayor rendimiento y un menor tiempo de procedimiento en comparación con el procedimiento de fraccionamiento clásico de Cohn-Oncly. Se reconstituye la IgG en tampón a un intervalo de pH ácido de 4, 60 a 4, 95, de preferencia 4, 9. Las proteínas no IgG se separan por dos etapas de incubación con caprilato en un intervalo de concentraciones de caprilato de 10 a 30 mM, de preferencia 20 mM.

Para la inactivación eficaz de los virus con envoltura, se puede añadir una incubación conocida como tratamiento con disolvente y detergente con TNBP y Triton X-100, Tween 80, etc., para aumentar la capacidad de inactivación de virus de todo el procedimiento. Se puede añadir una eliminación de virus por filtración, es decir por los así llamados filtros de nanofiltración o filtros cargados de profundidad, a los procedimientos de eliminación de virus. Además, el tratamiento UVC se puede realizar también en combinación con los tratamientos mencionados anteriormente. Tales tratamientos se describen por ejemplo en los documentos EP-A-0 840 624 o EP-A-0 422 007.

Además, el caprilato/ácido caprílico se puede combinar con o sustituir por heptanoato/ácido heptanoico para llevar a cabo la precipitación anteriormente mencionada y las etapas del procedimiento de incubación.

El producto obtenible por el procedimiento de la invención está viralmente inactivado. Los priones también son inactivados/eliminados debido al tratamiento con caprilato.

Las figuras 1 y 2 representan un diagrama de flujo de formas de realización particulares del procedimiento de la invención.

Descripción detallada de la invención La invención se refiere a un procedimiento para preparar una preparación de anticuerpos purificada, viralmente inactivada y viralmente segura a partir de una disolución de partida que comprende anticuerpos y contaminantes, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a) ajustar el pH de la disolución de partida a un valor entre 4, 6 y 4, 95, en particular a un valor entre 4, 8 y 4, 95, para producir una disolución intermedia;

(b) añadir iones... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para preparar una preparación de anticuerpos purificada, viralmente inactivada y viralmente segura, a partir de una disolución de partida que comprende anticuerpos y contaminantes, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a) ajustar el pH de la disolución de partida a un valor entre 4, 6 y 4, 95, en particular a un valor entre 4, 8 y 4, 95, para producir una disolución intermedia;

(b) añadir iones caprilato y/o heptanoato a la disolución intermedia y mantener el pH entre 4, 8 y 4, 95, con lo que se forma un precipitado y los anticuerpos están esencialmente presentes en el sobrenadante;

(c) incubar la disolución sobrenadante tras una segunda adición de iones caprilato y/o heptanoato en las mismas condiciones que en la etapa b) , realizar la filtración de la disolución resultante y opcionalmente concentrar y diafiltrar la disolución filtrada antes de ajustar el pH;

(d) aplicar la disolución filtrada a, al menos, una resina de intercambio de aniones a un pH de entre 5, 0 y 5, 2 y, opcionalmente, con dos resinas de intercambio de aniones diferentes, que une los contaminantes a la resina y al mismo tiempo no permite la unión de los anticuerpos a la resina, en el que se produce una preparación de anticuerpos purificada, viralmente inactivada y viralmente segura.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que se lleva a cabo una segunda cromatografía de intercambio de aniones a un intervalo de pH de 6, 7 a 6, 9.

3. El procedimiento de las reivindicaciones 1 y/o 2, en el que las etapas (b) y (c) son repetidas al menos una vez.

4. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la disolución de partida comprende anticuerpos derivados de plasma.

5. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a 4, en el que en la etapa (d) se pone la disolución inactivada en contacto con dos resinas de intercambio de aniones diferentes, de manera tal que los contaminantes se unen de manera selectiva a las resinas mientras que los anticuerpos no se unen a las resinas.

6. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los anticuerpos son inmunoglobulina G.

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el pH es ajustado a pH 6, 8 ± 0, 1 antes de la segunda cromatografía de intercambio de aniones.

8. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el flujo a través de la cromatografía de intercambio de aniones es concentrado de 60 a 90 mg/ml y es sometido a diafiltración contra una disolución tampón, de preferencia un tampón de fosfato.

9. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el flujo a través de la primera cromatografía de intercambio de aniones es tratado con disolvente y detergente, de preferencia por TnBP y Triton X-100, más preferentemente por concentraciones de Triton X-100 al 1 % y TnBP al 0, 3 % durante 4, 5 a 8 horas para inactivar los virus con cubierta lipídica.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que los detergentes de la mezcla de incubación son eliminados por extracción en fase sólida y líquida.

11. El procedimiento de al menos una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que al menos uno de los procedimientos seleccionado del grupo que consiste en tratamiento con UVC, tratamiento con calor, filtración de virus y eliminación o inactivación de priones, es combinado con un tratamiento con caprilato de la reivindicación 1.

12. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el valor del pH tras la extracción en fase sólida es ajustado a un valor entre 6, 7 y 6.9.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la disolución es sometido a la segunda cromatografía de intercambio de aniones.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el valor del pH del flujo a través del intercambiador de aniones es ajustado a un valor entre 3, 5 y 4, 5, de preferencia a un pH de 4, 0 ± 0, 1.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la disolución de IgG es puesta en contacto con un filtro de virus.

16. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la disolución de IgG es puesta en contacto con un nanofiltro.

17. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la disolución de IgG es incubada durante al menos 24 horas, de preferencia a 37 ºC ± 1.

18. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la disolución de IgG es concentrada al 5 o al 10 %.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que la osmolaridad del concentrado es ajustada de 200 a 400 mOsmol/kg.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que el pH de la disolución de IgG es ajustada a un valor entre 3, 5 y 6, 0, de preferencia a un valor de pH entre 4, 0 y 5, 5,

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que la disolución de IgG es filtrada de manera estéril y rellenada en frascos de vidrio o envases de plástico.