PRODUCTO DE CARTÍLAGO.

Producto de cartílago.

La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar un producto de cartílago que comprende un hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0,

5% y 3,0%, al menos un glicosaminoglicano y al menos un factor de crecimiento. De igual modo, la presente invención se refiere al producto de cartílago obtenible a través de dicho procedimiento. Dicho producto de cartílago es útil en el tratamiento o prevención de heridas, úlceras, quemaduras, la artrosis, la osteoporosis, enfermedades de los tendones y ligamentos, enfermedades periodontales, las señales de envejecimiento de la piel, los efectos dañinos de la exposición a la radiación ultravioleta o las estrías.

Producto de cartílago

Sector técnico de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar un producto de cartílago. De igual modo, la presente invención se refiere al producto de cartílago obtenible a través de dicho procedimiento, así como a los usos del mismo.

Antecedentes de la invención El proceso de cicatrización es un proceso complejo y dinámico que involucra la participación coordinada de distintos tipos celulares. Durante la primera fase de la cicatrización, denominada fase inflamatoria, las plaquetas, los neutrófilos, los granulocitos y los macrófagos, por medio de la liberación de factores de crecimiento, tienen una función central en la transición entre la inflamación y la reparación. Los factores de crecimiento liberados por los monocitos y los macrófagos son necesarios para la iniciación y propagación del nuevo tejido que recubrirá las heridas (A.J. Singer et al., N. Engl. J. Med. 341, 738-746 (1999) ) . Durante esta fase, el tejido degenerado es eliminado, lo cual constituye un pre-requisito para una cicatrización óptima. La segunda fase de la cicatrización de las heridas, denominada la fase regenerativa, se caracteriza por la proliferación celular y la síntesis de matriz extracelular. En este estado del proceso de cicatrización, se forma un tejido altamente vascularizado y varios tipos celulares, incluyendo macrófagos, fibroblastos, angioblastos y miofibroblastos se desplazan al lugar de la lesión. Los macrófagos proporcionan una fuente continua de factores de crecimiento, los fibroblastos proliferan y sintetizan una nueva matriz extracelular, lo cual conduce a la rápida formación del tejido de granulación, las células endoteliales generan un proceso de angiogénesis o de formación de nuevos vasos, que es estimulada por factores de crecimiento (VEGF y FGF) liberados por los macrófagos, pero también por los fibroblastos. Además de los factores angiogénicos, es también necesaria la presencia de una matriz extracelular adecuada formada por fibronectina, y la presencia de receptores endoteliales que reconozcan esta matriz extracelular. Durante la última fase del proceso, denominada fase reparativa, los fenómenos celulares principales son la producción de nuevo tejido conjuntivo formado por los fibroblastos principalmente y la proliferación y migración de los queratinocitos que conduce a la reepitelización de la herida.

Tan pronto como los fibroblastos sintetizan las fibras de colágeno de la nueva matriz extracelular, su actividad mitótica se reduce, al igual que la densidad celular y la vascularización del tejido. Tanto la deposición de colágeno como la orientación de los fibroblastos, está determinada por la fibronectina, la cual constituye la más importante proteína de la matriz extracelular en esta fase del proceso (D. Greiling et al., J. Cell. Sci. 110, 861-870 (1997) ) . La reepitelización fisiológica es iniciada por varios estímulos: factores de crecimiento; la ausencia de células vecinas en los márgenes de la herida, lo que dispara tanto la proliferación como la migración de las células epidérmicas; la pérdida de contacto de las células epidérmicas con la membrana basal, y el establecimiento de nuevas interacciones entre las células con los componentes de la matriz dérmica; la producción y liberación de colagenasa o MMP1 por las células epidérmicas y la activación de plasmina por el plasminógeno, el cual a su vez activa la colagenasa (Fini et al., Am. J. Pathol. 149, 1287-1302 (1996) ) .

Hay dos tipos de envejecimiento de la piel, el envejecimiento intrínseco o cronológico y el envejecimiento extrínseco, ligado mayoritariamente a las exposiciones solares (L. Rittié et al., Ageing Res. Rev. 1, 705-720 (2002) ) .

El envejecimiento intrínseco, también conocido como el proceso natural de envejecimiento, es un proceso continuo que suele empezar a partir de los 25 años.

Al proceso cronológico, se añade, para las mujeres, un envejecimiento debido a la disminución de la producción de estrógenos en la menopausia.

La firmeza, elasticidad e hidratación de la piel son consecuencias fundamentalmente de la matriz extracelular de la dermis que es secretada por los elementos celulares de la misma, los fibroblastos, y que consiste principalmente en colágeno de tipo I y III mayoritariamente, responsables de su firmeza y estructuración, la elastina, la cual confiere las propiedades elásticas de la misma, y el ácido hialurónico, principal glicosaminoglicano necesario para el mantenimiento de los niveles de hidratación. La densidad de la piel es consecuencia tanto de los elementos extracelulares como de los celulares. A mayor densidad de la piel, mayor número de células y mayor cantidad de elementos de la matriz extracelular (G. Jenkins, Mech. of Ageing Dev. 123, 801-810 (2002) ) .

Una composición cosmética anti-envejecimiento o anti-edad de la piel es aquella que por una parte es vigorizante, reestructurante e hidratante, y por la otra reduce los efectos que la edad provoca en la piel, modificando su aspecto tanto en la textura como en la rugosidad.

Una importante acción anti-envejecimiento se consigue cuando las células de la piel responden a la composición cosmética prolongando su ciclo vital, retrasando la manifestación de los síntomas de vejez celular, como son la limitación del crecimiento, la producción de proteínas extracelulares, el aumento de tamaño o la queratinización.

Otra propiedad crucial de un producto anti-envejecimiento es que sea capaz de disminuir los signos de la edad cuando ya están presentes en la piel.

Así pues, los fibroblastos están involucrados tanto en la acción antienvejecimiento de la piel, al ser responsables de la producción de colágeno, elastina y ácido hialurónico, tres elementos fundamentales para mantener la piel joven, como en el proceso de cicatrización de una herida.

Las metaloproteasas son enzimas proteolíticas que se encargan de la remodelación de la matriz extracelular y, en su conjunto, pueden degradar todos los constituyentes de ésta. Por su funcionalidad y según el sustrato que son capaces de degradar, se pueden agrupar en subfamilias.

Las metaloproteasas intervienen en la mayoría de procesos fisiológicos que requieren la remodelación de la matriz extracelular y tienen un papel bien definido en procesos celulares diversos como la proliferación, migración y la apoptosis. Además de esta función reparadora y de remodelación (reabsorción ósea, recambio endometrial, etc.) la presencia de niveles elevados de algunas metaloproteasas se ha asociado a la destrucción celular en una amplia variedad de procesos patológicos y del envejecimiento (K.C.N. Chang et al., Mol. Endocrinol. 22 (11) , 2407-2419 (2008) ; G.J. Fisher et al., Am. J. Pathol. 174 (1) , 101-114 (2009) ) .

El cartílago es un tipo de tejido conectivo flexible que reviste las articulaciones y da estructura a la nariz, los oídos, la laringe, la tráquea y otras partes del cuerpo. Es un tejido que no posee vasos sanguíneos, nervios, ni vasos linfáticos. Los peces cartilaginosos, también llamados elasmobranquios, tales como los tiburones y las rayas, tienen un esqueleto de cartílago.

Se han descrito tres tipos de tejido cartilaginoso, el cartílago hialino, el fibroso y el elástico. El cartílago hialino es el más importante del cuerpo, encontrándose en la nariz, la laringe, la tráquea, los bronquios, los arcos costales y los extremos articulares de los huesos.

El cartílago está constituido por 70%-80% de agua. Las principales sustancias que forman adicionalmente el cartílago son: los condrocitos, el colágeno, los proteoglicanos y el ácido hialurónico. Los proteoglicanos contienen, mayoritariamente, sulfato de condroitina y sulfato de queratano (D.W. Fawcett, 1995, Tratado de Histología, Ed. Interamericana McGraw-Hill, 12ª Edición, Madrid; D.W. Fawcett, 1986, Textbook of Histology, Ed. Chapman and Hall, 12th Edition, New York, London; T. Aigner et al., Advanced Drug Deliver y Reviews 55, 1569-1593 (2003) ) .

El colágeno es una proteína estructural compleja. Existen varios tipos de colágeno. En el cartílago, el colágeno más abundante es el de tipo II. Todos los colágenos están formados por tres cadenas polipeptídicas, las cuales se enrollan y se fijan mediante enlaces transversales para formar una triple hélice.

Los glicosaminoglicanos (GAG) son biomoléculas poliméricas de elevado peso molecular que consisten en una estructura dimérica repetida. Se encuentran fundamentalmente en los organismos vivos, donde desarrollan diferentes funciones fisiológicas. El glicosaminoglicano mayoritario en el cartílago es el sulfato de condroitina que tiene una estructura polimérica caracterizada...

R E I V I N D I C A C IO N E S

1. Un procedimiento para preparar un producto de cartílago que comprende las siguientes etapas: a) picar el cartílago; b) mezclar el cartílago picado y agua; c) calentar la mezcla de la etapa b) a una temperatura inferior a 60 °C; d) añadir una solución acuosa de H3PO4 para ajustar el pH de la mezcla de la etapa c) a un valor comprendido entre 1, 5 y 4, 5; e) tratar la mezcla ácida de la etapa d) con una cantidad de pepsina en peso respecto al peso del cartílago de la etapa a) comprendida entre 0, 6% y 4, 6%, durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 y 30 horas, de modo que se obtiene una solución; f) neutralizar la solución de la etapa e) con Ca (OH) 2, y g) filtrar la solución de la etapa f) que contiene sales insolubles, de modo que se obtiene una solución acuosa del producto de cartílago, en el que el producto de cartílago comprende un hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0, 5% y 3, 0%, al menos un glicosaminoglicano y al menos un factor de crecimiento.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende una etapa adicional después de la etapa g) , en la cual se obtiene un producto de cartílago sólido a partir de la solución acuosa de la etapa g) .

3. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que se obtiene un producto de cartílago sólido por atomización.

4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que en la etapa e) la cantidad de pepsina en peso respecto al peso del cartílago de la etapa a) está comprendida entre 0, 6% y 1, 0%, en la etapa d) el valor del pH está comprendido entre 3, 0 y 3, 5 y en la etapa c) la temperatura está comprendida entre 45 °C y 55 °C.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que en la etapa e) la cantidad de pepsina en peso respecto al peso del cartílago de la etapa a) está comprendida entre 0, 7% y 0, 8%, en la etapa e) el periodo de tiempo está comprendido entre 20 y 28 horas y en la etapa c) la temperatura es 50 °C.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa f) de neutralización se lleva a cabo después de (i) calentar la solución de la etapa e) durante una hora a una temperatura comprendida entre 75 °C y 90 °C; (ii) filtrar, y (iii) decolorar.

7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende una etapa adicional antes de la etapa a) , en la cual el cartílago se somete a una limpieza mecánica para eliminar grasa y tejidos no cartilaginosos.

8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el cartílago es cartílago de tráquea de mamífero.

9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que el cartílago de tráquea de mamífero es cartílago de tráquea porcina.

10. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el glicosaminoglicano se selecciona de entre el grupo que consiste en sulfato de condroitina, ácido hialurónico, sulfato de queratano y mezclas de los mismos, y el factor de crecimiento se selecciona de entre el grupo que consiste en TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB y mezclas de los mismos.

11. Un producto de cartílago obtenible por el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. El producto de cartílago según la reivindicación 11, caracterizado porque comprende: a) entre 67% y 87% en peso de hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0, 5% y 3, 0%, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; b) entre 15% y 25% en peso de sulfato de condroitina, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; c) entre 0, 1% y 1, 0% en peso de ácido hialurónico, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; d) entre 20 pg y 200 pg de TGF-β1 por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro; e) entre 20 pg y 200 pg de TGF-β3 por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro, y f) entre 20 pg y 200 pg de PDGF-BB por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro.

13. Un complemento alimenticio o un alimento funcional que comprende el producto de cartílago según la reivindicación 11 ó 12, y al menos un excipiente nutricional.

14. Una composición cosmética que comprende el producto de cartílago según la reivindicación 11 ó 12, y al menos un excipiente cosméticamente aceptable.

15. Una composición farmacéutica que comprende el producto de cartílago según la reivindicación 11 ó 12, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

16. Un producto de cartílago según la reivindicación 11 ó 12, para su uso como medicamento.

17. Uso de un producto de cartílago según la reivindicación 11 ó 12, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una herida y/o de una úlcera.

18. Uso de una composición cosmética según la reivindicación 14, para tratar, retardar o prevenir las señales de envejecimiento de la piel, los efectos dañinos de la exposición a la radiación ultravioleta o las estrías.

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300 250 200 150 100 50 0

Figura 1

Control Basal Control Positivo 50 ºg/ml 500 ºg/ml Producto de cartilago 2 mg/ml

Figura 2

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140 120 100 80 60 40 20 0

Figura 3

Control Basal TGF-º 10 ng/ml 250º g/ml 500º g/ml Producto de cartilago 2mg/ml

Figura 4