Producción microbiana de ácido L-ascórbico.

Un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de L-sorbosona deshidrogenasa capaz de convertir directamente L-sorbosona en ácido L-ascórbico,

seleccionándose dicho polinucleótido del grupo que consiste en:

(a) polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos según SEC ID NO:2, 12, 14, 16, 18, 20, 22, ó 27;

(b) polinucleótidos que comprenden la secuencia nucleotídica según SEC ID NO:1, 11, 13, 15, 17, 19, 21, ó 26;

(c) polinucleótidos cuya hebra complementaria se hibrida en condiciones restrictivas a un polinucleótido como se define en uno cualquiera de (a) a (b); y

(d) polinucleótidos que comparten al menos 80% de homología con un polinucleótido como se define en uno cualquiera de (a) a (b), con lo que se comparan al menos 100 nucleótidos consecutivos o la hebra complementaria de un polinucleótido que codifica un polipéptido según SEC ID NO:2 y que tiene actividad de L-sorbosona deshidrogenasa.

Producción microbiana de ácido L-ascórbico La presente invención se refiere a polinucleótidos derivados de polinucleótidos que codifican una enzima que convierte L-sorbosona directamente en ácido L-ascórbico. La enzima L-sorbosona deshidrogenasa (en lo siguiente: SNDHai) produce ácido L-ascórbico (vitamina C) directamente de L-sorbosona. La L-sorbosona deshidrogenasa (SNDHai) se derivó de bacterias que pertenecen al género Gluconobacter y Acetobacter. La presente invención se refiere además a un procedimiento para la producción de ácido L-ascórbico con rendimiento elevado. El ácido Lascórbico se usa ampliamente en las industrias farmacéutica, alimentaria y cosmética.

Durante los últimos 70 años, el ácido L-ascórbico (vitamina C) se ha producido industrialmente a partir de D-glucosa mediante el método de Reichstein bien conocido. Todas las etapas en este procedimiento son químicas excepto una (la conversión de D-sorbitol en L-sorbosa) , que se lleva a cabo mediante transformación microbiana. Desde su implementación inicial para la producción industrial de ácido L-ascórbico, se han usado varias modificaciones químicas y técnicas para mejorar la eficiencia del método de Reichstein. Desarrollos recientes de la producción de vitamina C se resumen en Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistr y , 5ª Edición, Vol. A27 (1996) , p. 547ff. Recientemente se han llevado a cabo diferentes etapas de producción de vitamina C con la ayuda de microorganismos o enzimas aisladas de ellos.

Los métodos actuales de producción para ácido L-ascórbico tienen algunas características indeseables tales como un consumo elevado de energía y uso de grandes cantidades de disolventes orgánicos e inorgánicos. Por lo tanto, durante las pasadas décadas, se han investigado otros enfoques para fabricar ácido L-ascórbico usando conversiones microbianas, que serían más económicas así como más ecológicas. La producción directa de ácido Lascórbico se ha dado a conocer en varios microorganismos.

La producción de ácido 2-ceto-L-gulónico (2-KGA) , un precursor de ácido L-ascórbico, usando un plásmido que posee los genes que codifican L-sorbosa deshidrogenasa (SDH) y L-sorbosona deshidrogenasa (SNDH) , se ha descrito por Saito et al. (Applied and Environmental Microbiology, Vol. 63, nº 2, 1997, 454-460) . Los genes correspondientes se han aislado de la cepa Gluconobacter oxydans T-100. Se describe la conversión de Lsorbosona en 2-KGA. Lee y Pan (Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 23, 1999, 106-111) describen un método de cribado para L-sorbosa y L-sorbosona deshidrogenasa para la producción de 2-KGA. En el documento WO 03/016508 se describe un procedimiento para producir 2-ceto-L-gulonato de sodio a partir de sorbitol y recuperar ácido 2-ceto-L-gulónico. La generación de cepas mutantes de Gluconobacter melanogenus a fin de incrementar la productividad de 2-KGA de tales cepas se ha descrito por Sugisawa et al. (Agricultural and Biological Chemistr y , Vol. 54, nº 5, 1990, 1201-1209) . Sin embargo, todas estas referencias no hablan sobre la conversión directa de L-sorbosona en ácido L-ascórbico. Además, el 2-KGA así producido se ha convertido además mediante un procedimiento químico en ácido L-ascórbico.

Se han descrito las secuencias parciales de un polinucleótido según SEC ID NO:1 (véase, por ejemplo, el número de acceso EMBL AE009265 o el documento WO 97/04101) , sin embargo, dirigido a diferentes secuencias nucleotídicas con actividades distintas de aquella de la L-sorbosona deshidrogenasa de la presente invención. Nuevamente, ambas referencias no dicen nada sobre la conversión directa de L-sorbosona en ácido L-ascórbico.

Las enzimas capaces de catalizar tanto la reacción de L-sorbosona a 2-KGA así como a ácido L-ascórbico se han descrito en los documentos WO 03/104445, WO 04/029269, WO 03/089634 o WO 04/029235. Sin embargo, estas enzimas tienen diferente especificidad de sustrato, diferentes secuencias y/o se aíslan de un microorganismo diferente, tal como, por ejemplo, Ketogulonicigenium vulgare DSM 4025. Además, el rendimiento en la producción de ácido L-ascórbico fue bastante bajo.

La conversión directa de un sustrato en ácido L-ascórbico mediante la actividad catalítica de una enzima, es decir, Lgulono-gamma-lactona deshidrogenasa, se ha descrito por Sugisawa et al. (Biosci. Biotech. Biochem., 59 (2) , 1995, 190-196) . Sin embargo, esta enzima necesita como sustrato L-gulono-gamma-lactona, y no puede catalizar la conversión de L-sorbosona en ácido L-ascórbico.

Sorprendentemente, ahora se ha encontrado que la conversión directa de L-sorbosona en ácido L-ascórbico se puede llevar a cabo usando la L-sorbosona deshidrogenasa (en lo sucesivo denominada SNDHai) aislada de G. oxydans N44-1 o enzimas que son ortólogos de la misma que se originan a partir de bacterias del ácido acético que pertenecen a los géneros Gluconobacter y Acetobacter. Se aisló un gen responsable de esta reacción, y se determinó la secuencia. La enzima sorbosona deshidrogenasa codificada por este gen convierte L-sorbosona en ácido L-ascórbico. Esta enzima es diferente de las enzimas SNDH conocidas. Ácido L-ascórbico o vitamina C, como se usa aquí de forma intercambiable, puede ser cualquier forma química de ácido L-ascórbico encontrada en disoluciones acuosas, tal como por ejemplo sin disociar, en su forma de ácido libre, o disociada como un anión. La forma salina solubilizada de ácido L-ascórbico se puede caracterizar como el anión en presencia de cualquier tipo de cationes encontrados habitualmente en sobrenadantes de fermentación, tales como por ejemplo potasio, sodio, amonio, o calcio. También pueden estar incluidos cristales aislados de la forma de ácido libre de ácido L-ascórbico.

Por otro lado, los cristales aislados de una forma salina de ácido L-ascórbico se denominan mediante su nombre salino correspondiente, es decir, ascorbato de sodio, ascorbato de potasio, ascorbato de calcio y similares.

La conversión de L-sorbosona en vitamina C significa que la conversión del sustrato que da como resultado la vitamina C se lleva a cabo mediante SNDHai, es decir, el sustrato se puede convertir directamente en vitamina C.

Un vector de clonación puede ser, por ejemplo, cualquier ADN plasmídico o fágico u otra secuencia de ADN que sea capaz de replicarse de forma autónoma en una célula hospedante, y que se caracteriza por un o un número pequeño de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción en los cuales se pueden cortar tales secuencias de ADN de una manera determinable sin pérdida de una función biológica esencial del vector, y en los que se puede ayustar un fragmento de ADN a fin de provocar su replicación. El vector de clonación puede contener además, por ejemplo, un marcador adecuado para uso en la identificación de células transformadas con el vector de clonación. Tales marcadores pueden proporcionar, por ejemplo, resistencia a antibióticos, tales como, por ejemplo, tetraciclina o ampicilina.

Un vector de expresión puede ser cualquier vector que sea capaz de potenciar la expresión de un gen que se ha clonado en él, después de, por ejemplo, la transformación en un hospedante. El gen clonado se coloca habitualmente bajo el control de (es decir, se enlaza operablemente a) ciertas secuencias de control tales como, por ejemplo, secuencias promotoras. Las secuencias promotoras pueden ser constitutivas o inducibles.

Una molécula de ácido nucleico puede incluir ADN y ARN. Cualquier forma, tal como, por ejemplo, ácido nucleico bicatenario, monocatenario, y sus nucleósidos, puede ser útil como molécula de ácido nucleico. También se incluyen híbridos, tales como, por ejemplo, híbridos de ADN-ARN, híbridos de ADN-ARN-proteína, híbridos de ARN-proteína, e híbridos de ADN-proteína. Un polinucleótido puede consistir en varias bases, habitualmente al menos 20 bases nucleotídicas.

El término “homología” designa la similitud de dos secuencias polinucleotídicas. A fin de determinar la homología, las secuencias polinucleotídicas se colocan de tal manera que se puedan comparar áreas similares. Si es necesario, se pueden sustituir nucleótidos en ciertas posiciones mediante una posición en blanco, a fin de mejorar la similitud. Las comparaciones de homología se pueden llevar a cabo, por ejemplo, manualmente o mediante el uso de programas de ordenador que están comercialmente disponibles. Preferiblemente, el programa se ejecuta en condiciones estándar, a fin de obtener la homología máxima. El grado de homología o similitud entre dos secuencias nucleotídicas se da en “% de homología”.

Una mutación puede ser, por ejemplo, un único cambio,... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de L-sorbosona deshidrogenasa capaz de convertir directamente L-sorbosona en ácido L-ascórbico, seleccionándose dicho polinucleótido del grupo que consiste en:

(a) polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos según SEC ID NO:2, 12, 14, 16, 18, 20, 22, ó 27;

(b) polinucleótidos que comprenden la secuencia nucleotídica según SEC ID NO:1, 11, 13, 15, 17, 19, 21, ó 26;

(c) polinucleótidos cuya hebra complementaria se hibrida en condiciones restrictivas a un polinucleótido como se define en uno cualquiera de (a) a (b) ; y

(d) polinucleótidos que comparten al menos 80% de homología con un polinucleótido como se define en uno cualquiera de (a) a (b) , con lo que se comparan al menos 100 nucleótidos consecutivos

o la hebra complementaria de un polinucleótido que codifica un polipéptido según SEC ID NO:2 y que tiene actividad de L-sorbosona deshidrogenasa.

2. Un polipéptido codificado por un polinucleótido según la reivindicación 1 y que tiene actividad de L-sorbosona deshidrogenasa capaz de convertir directamente L-sorbosona en ácido L-ascórbico.

3. Un microorganismo que posee un vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 1, y en el que dicho polinucleótido está sobreexpresado.

4. El microorganismo según la reivindicación 3, en el que el microorganismo es una bacteria de un género seleccionado del grupo que consiste en Gluconobacter, Acetobacter, Pseudomonas y Escherichia.

5. Un procedimiento para la producción de ácido L-ascórbico a partir de un sustrato seleccionado del grupo que consiste en D-sorbitol, L-sorbosa y L-sorbosona, que comprende:

(a) propagar el microorganismo según la reivindicación 3 ó 4 que codifica el polipéptido según la reivindicación 2 en un medio de cultivo apropiado para convertir directamente L-sorbosona en ácido Lascórbico, y

(b) recuperar y separar ácido L-ascórbico de dicho medio de cultivo.

6. Un procedimiento para la producción de ácido L-ascórbico a partir de un sustrato seleccionado del grupo que consiste en D-sorbitol, L-sorbosa y L-sorbosona, que comprende:

(a) propagar un microorganismo que codifica el polipéptido según la reivindicación 2 que tiene actividad de Lsorbosona deshidrogenasa en un medio de cultivo apropiado,

(b) aislar y purificar dicha L-sorbosona deshidrogenasa,

(c) incubar el sustrato en presencia de dicha L-sorbosona deshidrogenasa de (b) para convertir directamente L-sorbosona en ácido L-ascórbico, y

(d) recuperar y separar ácido L-ascórbico a partir de la mezcla de reacción.

7. Un procedimiento para la producción de L-sorbosona deshidrogenasa según la reivindicación 2, en el que un microorganismo que codifica el polipéptido según la reivindicación 2 se propaga en un medio de cultivo apropiado, las células se disgregan y se aísla la L-sorbosona deshidrogenasa.

8. El procedimiento para la producción de ácido L-ascórbico según la reivindicación 5 ó 6 usando células en reposo de dicho microorganismo, en el que el rendimiento de ácido L-ascórbico producido es al menos 1, 8 g/l.

9. El procedimiento según la reivindicación 5 ó 6, que comprende las etapas de:

(a) cultivar el microorganismo según la reivindicación 3 ó 4 en condiciones que permiten el crecimiento,

(b) cambiar las condiciones de manera que se reduce la velocidad de crecimiento de dicho microorganismo conduciendo a células en reposo; y

(c) producir ácido L-ascórbico a partir del sustrato usando las células en reposo de (b) . en el que la etapa (a) y (c) no están separadas por ninguna etapa de lavado ni de aislamiento.

10. El procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, en el que la densidad de las células en reposo en el medio de producción, medida como OD a 600 nm, es al menos 10.

11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que usa un microorganismo capaz de

producir tanto ácido L-ascórbico como ácido 2-ceto-L-gulónico a partir de un sustrato, y en el que la relación entre la 5 concentración de ácido L-ascórbico y 2-KGA es mayor que 0, 1.

12. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, que comprende además aislar ácido Lascórbico del medio y opcionalmente una o más etapas de purificación.

13. El procedimiento según la reivindicación 12, en el que todas las etapas de purificación se llevan a cabo en un entorno acuoso.

14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 u 8 a 13, que comprende además la separación de ácido L-ascórbico a partir de los componentes en el medio usando electrodiálisis.

15. Uso de un polipéptido según la reivindicación 2, o un microorganismo según la reivindicación 3 ó 4, para la producción de ácido L-ascórbico directamente a partir de L-sorbosona.