Procedimientos para la generación de preparaciones de vectores de AAV recombinantes de títulos altos exentas de auxiliares.

Un procedimiento de generación de una población de partículas de virus adenoasociadosrecombinantes (AAVr) que comprende las etapas de:

(a) incubar la célula productora de AAV en condiciones que sean permisivas para la replicación de AAV y quecomprenden inducir un estrés subletal en la célula productora de AAV para potenciar el nivel de producción de AAV,en el que la célula productora de AAV es una célula de mamífero, y en el que dicha célula comprende:

(i) uno o más genes de empaquetamiento de AAV, en el que cada uno de dichos genes de empaquetamiento deAAV codifica una proteína de replicación o encapsidación de AAV;

(ii) un provector de AAV recombinante (AAVr) que comprende un polinucleótido no de AAV heterólogo flanqueadopor al menos una repetición terminal invertida (RTI); y

(iii) un virus auxiliar de AAV,

(b) lisar la célula productora después de la incubación de la etapa a) para producir un lisado de célula productora deAAV; y

(c) purificar el lisado de célula productora de AAV para generar una población de partículas de virus adenoasociadosrecombinantes (AAVr),

en el que el estrés subletal se selecciona de:

(I) un estrés nutricional impuesto por uno o más de los siguientes:

(i) cultivar la célula productora en un medio que sea deficiente en uno o más aminoácidos, opcionalmente ácidoaspártico o ácido glutámico;

(ii) cultivar la célula productora en un medio que contenga menos de 10 μmol/l de ácido aspártico;

(iii) cultivar la célula productora en un medio que contenga menos de 2 μmol/l de ácido glutámico; o

(iv) cultivar la célula productora en un medio que sea deficiente en suero; o

(II) un estrés térmico impuesto al cultivar la célula productora durante 3-6 días a:

(i) una temperatura menor que la temperatura de crecimiento óptima de la célula productora; o

(ii) una temperatura mayor que la temperatura de crecimiento óptima de la célula productora; o

(III) un estrés osmótico impuesto:

(i) al cultivar la célula productora en un medio hipoosmótico; o

(ii) al cultivar la célula productora en un medio hiperosmótico; o

(IV) un estrés de pH, en el que el estrés de pH comprende someter la célula productora a un pH deaproximadamente pH 7,2 continuamente durante el cultivo; o

(V) un estrés tóxico, en el que el estrés tóxico comprende exponer la célula productora a un agente genotóxicoseleccionado de un carcinógeno químico, radiación, UV, un inhibidor metabólico de la síntesis de ADN y un fármacoque afecte a las topoisomerasas.

Procedimientos para la generación de preparaciones de vectores de aav recombinantes de títulos altos exentas de auxiliares Campo de la invención [0001] La presente divulgación se refiere en general al campo de los vectores de virus adenoasociados (AAV) recombinantes y a preparaciones de los mismos que pueden usarse para transferencia génica. Más específicamente, se refiere a procedimientos para generar preparaciones de títulos altos de vectores de AAV recombinantes que estén sustancialmente exentas de virus auxiliares (por ejemplo adenovirus) así como de proteínas celulares.

Antecedentes [0002] Los virus adenoasociados (AAV) tienen rasgos únicos que los hacen atractivos como vectores para terapia génica. Los virus adenoasociados infectan un amplio intervalo de tipos celulares. Sin embargo, no son transformantes y no están implicados en la etiología de ninguna enfermedad humana. La introducción de ADN en células hospedadoras receptoras conduce generalmente a la persistencia a largo plazo y la expresión del ADN sin alterar el metabolismo normal de la célula.

Existen al menos tres rasgos deseables de una preparación de vector de AAV recombinante para uso en transferencia génica, especialmente en terapia génica humana. En primer lugar, se prefiere que el vector se genere a títulos suficientemente altos para transducir una proporción eficaz de células en el tejido diana. La terapia génica in vivo requiere típicamente un alto número de partículas vectoriales. Por ejemplo, algunos tratamientos pueden requerir más de 108 partículas, y el tratamiento de fibrosis quística mediante suministro directo a las vías respiratorias puede requerir más de 1010 partículas. En segundo lugar, se prefiere que las preparaciones vectoriales estén esencialmente exentas de AAV competentes de replicación (concretamente, AAV de tipo fenotípicamente silvestre que pueda replicarse en presencia de virus auxiliares o funciones de virus auxiliares) . En tercer lugar, se prefiere que la preparación de vector de AAVr en conjunto esté esencialmente exenta de otros virus (tales como un virus auxiliar usado en la producción de AAV) así como de virus auxiliares, proteínas celulares y otros componentes tales como lípidos y carbohidratos, para minimizar o eliminar cualquier riesgo de generación de una respuesta inmunitaria en el contexto de la terapia génica. Este último punto es especialmente significativo en el contexto de los AAV, porque el AAV es un virus “dependiente de auxiliar” que requiere coinfección con un virus auxiliar (típicamente adenovirus) u otra provisión de funciones de virus auxiliar para replicarse y empaquetarse eficazmente durante el proceso de producción de AAV y, además, se ha observado que los adenovirus generan una respuesta inmunitaria en el hospedador en el contexto de aplicaciones de terapia génica (véanse, por ejemplo, Byrnes y col., Neuroscience 66: 1015, 1995; McCoy y col., Human Gene Therapy 6: 1553, 1995 y Barr y col., Gene Therapy 2: 151, 1995) . Los procedimientos de la presente divulgación se dirigen a estos y otros rasgos deseables de preparaciones de vector de AAVr como se describen e ilustran con detalle a continuación.

Están disponibles en otro lugar revisiones generales de la virología y genética de los AAV. El lector puede remitirse, entre otros, a Carter, "Handbook of Parvoviruses", vol. I, pág. 169-228 (1989) y Berns, "Virology", pág. 1743-1764, Raven Press, (1990) . Lo siguiente es una breve sinopsis para conveniencia del lector. El AAV es un virus defectivo de replicación, lo que significa que se apoya en un virus auxiliar para completar su ciclo de replicación y empaquetamiento en una célula hospedadora. El genoma de AAV comprende generalmente los genes de empaquetamiento rep y cap, estando proporcionadas otras funciones necesarias en trans por el virus auxiliar y la célula hospedadora.

Las partículas de AAV comprenden una cápsida proteica que tiene tres proteínas de cápsida, VP1, VP2 y VP3, que engloban un genoma de ADN monocatenario lineal de ~4, 6 kb. Las partículas individuales empaquetan solo una hebra de molécula de ADN, pero esta puede ser la hebra positiva o negativa. Las partículas que contienen cualquier hebra son infecciosas, y la replicación ocurre mediante conversión de la hebra individual infecciosa progenitora en una forma de dúplex y la posterior amplificación, de la que las hebras individuales de progenie se desplazan a y empaquetan en cápsidas. Las copias de dúplex o monocatenarias de genomas de AAV (a veces designadas como “ADN provírico” o “provirus”) pueden insertarse en plásmidos o fagémidos bacterianos, y transfectarse a células infectadas con adenovirus.

A modo de ilustración, el genoma lineal del serotipo AAV2 está terminado en cada extremo por una secuencia de repetición terminal invertida (RTI) . Entre las RTI hay tres promotores de transcripción p5, p19 y p40 que se usan para expresar los genes rep y cap (Laughlin y col., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5567-5571) . Las secuencias de RTI son necesarias en cis y son suficientes para proporcionar un origen de replicación funcional, la integración en el genoma celular y una escisión eficaz y recuperación de los cromosomas de la célula hospedadora o plásmidos recombinantes. Los productos génicos de rep y cap proporcionan funciones para la replicación y encapsidación de genoma vírico, respectivamente, y es suficiente con que estén presentes en trans.

El gen rep se expresa por dos promotores, p5 y p19, y produce cuatro proteínas designadas Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40. Solo se requieren Rep78 y Rep68 para la replicación de ADN de dúplex de AAV, pero Rep52 y Rep40 parecen ser necesarias para la acumulación de ADN monocatenario de progenie (Chejanovsky y col., Virology 173: 120, 1989) . Rep68 y Rep78 se unen específicamente a la conformación de horquilla de RTI de AAV y poseen varias actividades enzimáticas necesarias para resolver la replicación en los extremos de AAV. Rep78 y Rep68 exhiben también actividades reguladoras pleyotrópicas que incluyen regulación positiva y negativa de los genes de AAV y expresión por algunos promotores heterólogos, así como efectos inhibidores sobre el crecimiento celular. El gen cap codifica las proteínas de cápsida VP1, VP2 y VP3. Estas proteínas comparten una secuencia superpuesta común, pero VP1 y VP2 contienen secuencias aminoterminales adicionales transcritas por el promotor p40 mediante el uso de codones de iniciación alternativos. Se requieren las tres proteínas para una producción de cápsida eficaz.

Los genomas de AAV se han introducido en plásmidos bacterianos mediante procedimientos tales como prolongación de CG (Samulski y col., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 2077-2081) , adición de ligadores sintéticos que contienen sitios de escisión de endonucleasa de restricción (Laughlin y col., 1983, Gene, 23: 65-73) o mediante ligamiento de extremo romo directo (Senapathy y Carter, 1984, J. Biol. Chem., 59: 4661-4666) . La transfección de dichos plásmidos recombinantes de AAV en células de mamífero con un virus auxiliar apropiado da como resultado la recuperación y escisión del genoma de AAV exento de cualquier secuencia plasmídica, la replicación del genoma recuperado y la generación de partículas de AAV infecciosas de progenie.

Pueden construirse vectores de AAV recombinantes que comprenden un polinucleótido heterólogo de interés terapéutico sustituyendo porciones de la secuencia de codificación de AAV en plásmidos bacterianos por el polinucleótido heterólogo. Los principios generales de construcción de un vector de AAVr se revisan también en otro lugar. Véanse, por ejemplo, Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 3: 533-539 y Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbiol. and Immunol., 158: 97-129) . Las RTI de AAV se retienen generalmente, puesto que el empaquetamiento del vector requiere que estén presentes en cis. Sin embargo, pueden omitirse otros elementos del genoma de AAV, en particular, uno o más de los genes de empaquetamiento. El plásmido vectorial puede empaquetarse en una partícula de AAV suministrando los genes de empaquetamiento omitidos en trans a través de una fuente alternativa.

En un enfoque, se introducen la secuencia flanqueada por RTI de AAV (la secuencia del vector de AAVr) y los genes de empaquetamiento de AAV a proporcionar en trans en la célula hospedadora en plásmidos bacterianos separados. Se describen ejemplos de este enfoque en Ratschin y col., Mol. Cell. Biol. 4: 2072 (1984) ; Hermonat y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6466 (1984) ; Tratschin y col., Mol. Cell. Biol. 5: 3251 (1985) ; McLaughlin y col., J. Virol., 62: 1963 (1988) y Lebkowski y col., 1988 Mol. Cell. Biol., 7: 349 (1988) .... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de generación de una población de partículas de virus adenoasociados recombinantes (AAVr) que comprende las etapas de:

(a) incubar la célula productora de AAV en condiciones que sean permisivas para la replicación de AAV y que comprenden inducir un estrés subletal en la célula productora de AAV para potenciar el nivel de producción de AAV, en el que la célula productora de AAV es una célula de mamífero, y en el que dicha célula comprende:

(i) uno o más genes de empaquetamiento de AAV, en el que cada uno de dichos genes de empaquetamiento de AAV codifica una proteína de replicación o encapsidación de AAV;

(ii) un provector de AAV recombinante (AAVr) que comprende un polinucleótido no de AAV heterólogo flanqueado por al menos una repetición terminal invertida (RTI) ; y

(iii) un virus auxiliar de AAV,

(b) lisar la célula productora después de la incubación de la etapa a) para producir un lisado de célula productora de AAV; y

(c) purificar el lisado de célula productora de AAV para generar una población de partículas de virus adenoasociados recombinantes (AAVr) ,

en el que el estrés subletal se selecciona de:

(I) un estrés nutricional impuesto por uno o más de los siguientes:

(i) cultivar la célula productora en un medio que sea deficiente en uno o más aminoácidos, opcionalmente ácido aspártico o ácido glutámico;

(ii) cultivar la célula productora en un medio que contenga menos de 10 μmol/l de ácido aspártico;

(iii) cultivar la célula productora en un medio que contenga menos de 2 μmol/l de ácido glutámico; o

(iv) cultivar la célula productora en un medio que sea deficiente en suero; o

(II) un estrés térmico impuesto al cultivar la célula productora durante 3-6 días a:

(i) una temperatura menor que la temperatura de crecimiento óptima de la célula productora; o

(ii) una temperatura mayor que la temperatura de crecimiento óptima de la célula productora; o

(III) un estrés osmótico impuesto:

(i) al cultivar la célula productora en un medio hipoosmótico; o

(ii) al cultivar la célula productora en un medio hiperosmótico; o

(IV) un estrés de pH, en el que el estrés de pH comprende someter la célula productora a un pH de aproximadamente pH 7, 2 continuamente durante el cultivo; o

(V) un estrés tóxico, en el que el estrés tóxico comprende exponer la célula productora a un agente genotóxico seleccionado de un carcinógeno químico, radiación, UV, un inhibidor metabólico de la síntesis de ADN y un fármaco que afecte a las topoisomerasas.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el estrés subletal es un estrés tóxico y el agente genotóxico es un inhibido metabólico de la síntesis de ADN seleccionado de hidroxiurea, metotrexato y afidocolina.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el estrés subletal es un estrés tóxico y el agente genotóxico es un fármaco que afecta a topoisomerasas seleccionado de amsacrina, camptotecina, etopósido y novobiocina.

4. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha etapa de purificación c) comprende someter a cromatografía el lisado de célula productora de AAV de la etapa b) mediante una pluralidad de cromatografías de intercambio iónico que comprenden al menos una cromatografía de intercambio aniónico cargada positivamente y al menos una

cromatografía de intercambio catiónico cargada negativamente, o someter a cromatografía el lisado de célula productora de AAV de la etapa b) mediante una cromatografía de intercambio aniónico seguida de filtración por filtro tangencial para generar una población purificada de partículas de vector de AAVr.

5. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho lisado de célula productora de AAV se purifica también por afinidad en una resina que tiene un ligando que es específico de una o más moléculas de superficie presentes en AAV, y en el que la purificación por afinidad se realiza opcionalmente después de una cromatografía de intercambio aniónico y/o catiónico y dicho ligando es opcionalmente un anticuerpo que es específico de una molécula de superficie presente en AAV.

6. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula productora de AAV de la etapa a) se concentra antes de la lisis, opcionalmente mediante centrifugación o mediante filtración por flujo tangencial.

7. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha etapa de lisis de la célula productora de AAV se realiza sometiendo la célula a una técnica lítica seleccionada de microfluidificación, sonicación y liofilización.

8. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el lisado de célula productora de AAV de la etapa b) :

(i) se trata con una nucleasa, opcionalmente benzonasa, antes de la cromatografía; y/o

(ii) se clarifica antes de la cromatografía, opcionalmente mediante filtración o centrifugación.

9. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula productora de AAV se concentra antes de la lisis, se resuspende en un tampón que comprende disolución salina a una fuerza iónica de al menos una disolución de NaCl 50 mM, se lisa y se clarifica entonces mediante filtración antes de la cromatografía.

10. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según la reivindicación 4 o cualquier reivindicación dependiente de la misma, en el que las fracciones cromatográficas que contienen partículas de AAVr se concentran mediante filtración o centrifugación después de elución de una cromatografía de intercambio iónico.

11. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según la reivindicación 4 o cualquier reivindicación dependiente de la misma, en el que las fracciones cromatográficas que contienen partículas de AAVr se concentran mediante filtración por flujo tangencial después de elución de una cromatografía de intercambio iónico.

12. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según la reivindicación 4 o cualquier reivindicación dependiente de la misma, en el que dicha cromatografía de intercambio aniónico se efectúa en una resina amino o imino N-cargada, opcionalmente seleccionada de una resina POROS 50 PI, una resina de dietilaminoetilo (DEAE) , una resina de trimetilaminoetilo (TMAE) , una resina de amina cuaternaria y una resina de polietilenimina (PEI) .

13. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según la reivindicación 4 o cualquier reivindicación dependiente de la misma, en el que dicha cromatografía de intercambio catiónico se efectúa en una resina catiónica basada en azufre, fósforo o carboxilo, opcionalmente seleccionada de una resina de sulfato de heparina (HS) , una resina de sulfopropilo (SP) y una resina de carboximetilo (CM) .

14. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha etapa a) de incubación de la célula productora se realiza en un recipiente seleccionado de un matraz de cultivo de tejido, un frasco giratorio, un matraz de agitación, un reactor en tanque, un fermentador tal como un fermentador de agitación de aire, un biorreactor tal como un biorreactor de fibra hueca, de lecho empaquetado o lecho fluidificado o un biorreactor multilecho en el que en el biorreactor multilecho se aíslan al menos 109 unidades replicativas de AAVr por litro de volumen de biorreactor.

15. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha etapa a) de incubación de la célula productora se realiza usando un microportador.

16. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha etapa a) de incubación de la célula productora se realiza durante al menos 5 días.

17. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según la reivindicación 4 o cualquier reivindicación dependiente de la misma, en el que dicha población purificada de partículas de vector de AAVr contiene:

- menos de 1 AAV competente de replicación por 104 partículas de AAV;

- no más de 103 partículas infecciosas de virus auxiliar por 108 unidades replicativas de partículas de AAVr;

-menos de un 5% de contaminación por virus auxiliar basada en proteína (p/p) , detectada por análisis densitométricos de geles de SDS o mediante inmunoensayo de proteína específica de virus auxiliares, y

- menos de un % de contaminación por virus auxiliar o proteína celular (p/p) , detectada por análisis densitométricos de geles de SDS o mediante inmunoensayo de virus auxiliares o proteínas específicas celulares.

18. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según la reivindicación 4 o cualquier reivindicación dependiente de la misma, en que la elución de la cromatografía de intercambio aniónico y/o intercambio catiónico se realiza aumentando la concentración salina y los eluyentes cromatográficos que comprenden las partículas de AAVr se tratan posteriormente para reducir la concentración salina eficaz mediante dilución, diálisis, diafiltración o concentración.

19. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente la etapa de someter una fracción que comprende partículas de AAV a cromatografía de sulfato de heparina.

20. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho provector de AAVr comprende un polinucleótido no de AAV heterólogo flanqueado por dos repeticiones terminales invertidas (RTI) de AAV.

21. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha célula productora de AAV comprende al menos un gen de empaquetamiento de AAV que se integra establemente en el genoma de dicha célula productora de AAV, preferiblemente un gen rep de AAV y un gen cap de AAV.

22. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha célula productora se proporciona mediante un proceso que comprende:

(i) introducir el virus auxiliar en la célula productora en que ya se ha introducido el gen o genes de empaquetamiento de AAV y el provector de AAVr;

(ii) introducir el provector de AAVr y el virus auxiliar simultánea o secuencialmente en la célula productora en que ya se ha introducido el gen o genes de empaquetamiento de AAV; o

(iii) introducir el gen o genes de empaquetamiento de AAV y el provector de AAVr simultánea o secuencialmente en la célula hospedadora en que ya se ha introducido el virus auxiliar.

23. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula productora se proporciona mediante un proceso que comprende introducir en la célula productora al menos un gen de división-empaquetamiento de AAV.

24. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho virus auxiliar es un adenovirus, un adenovirus termosensible o adenovirus Ad-ts149.

25. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho virus auxiliar es un virus auxiliar termosensible y dicha etapa de incubación de la célula productora se realiza a una temperatura que es permisiva de replicación de AAV pero no permisiva de replicación del virus auxiliar termosensible.

26. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula productora es una línea celular de mamífero dependiente de unión, una línea celular de mamífero adaptada a suspensión, una célula N3S de 293 o una célula S3 de HeLa.

27. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según la reivindicación 1, en el que dicha etapa de purificación c) comprende una combinación de una cromatografía de intercambio aniónico

cargada positivamente y una cromatografía de intercambio catiónico cargada negativamente para generar una población purificada de partículas de AAVr.

28. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según la reivindicación 27, en el que dicha cromatografía de intercambio aniónico cargada positivamente se efectúa antes de dicha cromatografía de intercambio catiónico cargada negativamente.

29. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según la reivindicación 27, en el que dicha cromatografía de intercambio catiónico cargada negativamente se efectúa antes de dicha cromatografía de intercambio aniónico cargada positivamente.

30. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, que comprende adicionalmente la etapa de someter a cromatografía el lisado que contiene partículas de AAVr en sulfato de heparina, efectuándose dicha etapa después de dicha cromatografía de intercambio aniónico cargada positivamente y de dicha cromatografía de intercambio catiónico cargada negativamente.

31. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, que comprende adicionalmente la etapa de someter la célula productora a filtración por flujo tangencial.

32. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según la reivindicación 31, en el que la filtración por flujo tangencial se efectúa antes de la cromatografía.

33. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según la reivindicación 31, en el que dicha filtración por flujo tangencial se efectúa después de la cromatografía.

34. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que dicha cromatografía de intercambio aniónico se efectúa en una resina de amino o imino N-cargada, opcionalmente seleccionada de una resina POROS 50 PI, una resina de dietilaminoetilo (DEAE) , una resina de trimetilaminoetilo (TMAE) , una resina de amina cuaternaria y una resina de polietilenimina (PEI) .

35. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que dicha cromatografía de intercambio catiónico se efectúa en una resina catiónica basada en azufre, fósforo o carboxilo, opcionalmente seleccionada de una resina de sulfato de heparina (HS) , una resina de sulfopropilo (SP) y una resina de carboximetilo (CM) .

36. Un procedimiento de generación de una población de partículas de AAVr según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 35, en el que la célula productora se cultiva en condiciones de suspensión.