Procedimientos a base de micro-ARN y composiciones para el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades relacionadas con el colon.

Un procedimiento para diagnosticar si un sujeto tiene un pronóstico de menor supervivencia de unadenocarcinoma de colon,

que comprende medir el nivel de al menos un producto génico de miR-21 en una muestrade ensayo del sujeto en el que un incremento en al menos el nivel del producto génico de miR en la muestra deensayo con respecto al nivel de un correspondiente producto génico de miR en una muestra control, es indicativo deque el sujeto tiene un mal pronóstico de supervivencia del adenocarcinoma de colon.

Procedimientos a base de micro-ARN y composiciones para el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades relacionadas con el colon 5

Antecedentes de la invención El adenocarcinoma de colon es una causa principal de mortalidad en todo el mundo1. El cáncer colorrectal es la tercera causa más frecuente y la segunda causa principal de muerte por cáncer en EE.UU2. Los adenocarcinomas de colon esporádicos se inician como adenomas y evolucionan a través de una progresión de cambios moleculares, celulares e histológicos3. Aunque las tasas de mortalidad a los 5 años han disminuido modestamente en las últimas 3 décadas4, sigue existiendo la necesidad de identificar nuevos biomarcadores pronósticos y dianas terapéuticas para esta enfermedad. En la actualidad, la quimioterapia tiene un valor terapéutico significativo pero la cirugía es la única forma curativa de tratamiento5.

Los objetivos terapéuticos ideales deberían asociarse causalmente con enfermedad y ser propensos a diseñar intervenciones terapéuticas; mientras que los biomarcadores ideales deberían ser fáciles de medir y tener fuertes asociaciones con resultados clínicos. Los microARN podrían cumplir ambos criterios6-8 .

Los microARN son moléculas de ARN no codificante de 18-25 nucleótidos que regulan la traducción de muchos genes 9. Desde su descubrimiento 10, 11, se ha encontrado que regulan diversos procesos celulares entre los que se incluyen apoptosis 12-14, diferenciación10, 11, 15 y proliferación celular16. Los microARN también pueden tener un papel causal en la carcinogénesis 6, 17, los niveles de expresión de los microRNA están alterados en la mayoría de los tipos de tumores18, 19, incluidos los tumores de colon19-22. Los microARN miR-15 y miR-16a están eliminados o regulados por disminución en la mayoría de las leucemias linfocíticas crónicas23. La manipulación experimental de los microARN específicos modula el desarrollo tumoral en sistemas de modelos de ratón 16, 24-26. El potencial pronóstico de los microARN también se ha demostrado para la leucemia linfocítica crónica7, el cáncer de pulmón8 y los neuroblastomas27.

La expresión aberrante de los microARN puede ser causa de carcinogénesis, la inhibición de microARN específicos puede tener implicaciones terapéuticas. Se pueden diseñar oligonucleótidos antisentido modificados para inhibir específicamente la función del microARN28. Los antagomires son un tipo de oligonucleótidos antisentido que se ha demostrado que son eficaces en la inhibición de la función de microRNA in vivo en ratones29. La facilidad de diseño de inhibidores específicos de la función de los microARN les convierte en candidatos a objetivos terapéuticos

Sumario de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para diagnosticar si un sujeto tiene un pronóstico de menor supervivencia para una enfermedad relacionada con el cáncer de colon, que comprende medir el nivel de al menos un producto génico de miR-21 en una muestra de ensayo del sujeto en el que dicho sujeto en el que una alteración en al nivel del producto génico de miR en la muestra de ensayo con respecto al nivel de un correspondiente producto génico de miR en una muestra control, es indicativo de que el sujeto tiene la enfermedad relacionada con el cáncer de colon o está en riesgo de desarrollarla.

La invención también se refiere a un procedimiento de diagnóstico de si un sujeto tiene un pronóstico de menor supervivencia para una enfermedad relacionada con el cáncer de colon, que comprende:

(1) determinar un nivel de expresión de al menos un marcador en una muestra de un sujeto de ensayo; el al menos un marcador incluye al menos un producto génico de miR-21;

(2) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa (1) con un nivel de expresión control del marcador en una muestra de un sujeto sano; y

(3) juzgar que el sujeto tiene una enfermedad relacionada con el cáncer de colon cuando el resultado de la comparación en la etapa (2) indica que:

(i) el nivel de expresión del al menos un marcador en el sujeto de ensayo es mayor que en el control; o (ii) el nivel de expresión del al menos un marcador en el sujeto de ensayo es menor que en el control.

La muestra puede comprender uno o más de tejido, sangre, suero, plasma, suero, orina y heces. Asimismo, todas las etapas del procedimiento se pueden realizar in Vitro.

En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un procedimiento asistido para diagnosticar si un sujeto tiene un pronóstico de menor supervivencia para una enfermedad relacionada con el cáncer de colon, o está en riesgo de desarrollarla, que comprende:

(1) transcripción inversa de ARN desde una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un grupo de oligodesoxinucleótidos diana;

(2) hibridación de los oligodesoxinucleótidos diana con una micromatriz que comprende sondas oligonucleotídicas específicas de miRNA-181b para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de ensayo; y

(3) comparación del perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación generado a partir de

una muestra control, en el que una alteración en la señal de al menos un miRNA es indicativa de que el sujeto tiene un pronóstico de menor supervivencia para una enfermedad relacionada con el cáncer de colon, o está en riesgo de desarollarla.

En un aspecto concreto, la señal de al menos un miRNA respecto a la señal generada a partir de la muestra control está regulada por aumento o por disminución, Asimismo, la micromatriz puede comprender sondas oligonucleotídicas específicas de miARN para uno o más miARN seleccionados del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos.

En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un procedimiento de inhibición de la tumorigénesis en un sujeto que tiene, o se sospecha que tiene, una enfermedad relacionada con cáncer de colon, en el que al menos un producto génico miR seleccionado del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR1816, miR-203 y combinaciones de los mismos está regulado por disminución o regulado por aumento en las células cancerosas del sujeto, con respecto a las células control, que comprende:

(1) cuando el al menos un producto génico de miR está regulado por disminución en las células cancerosas, administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un producto génico de miR aislado, seleccionado del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos, de modo que la tumorigénesis en el sujeto está inhibida; o (2) cuando el al menos un producto génico de miR está regulado por aumento en las células cancerosas, administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresión del al menos un producto génico de miR seleccionado del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos, de modo que la tumorigénesis en el sujeto está inhibida.

En un aspecto concreto, el al menos un producto génico de miR aislado en la etapa (1) y/o en la etapa (2) es miR-21

o una variante aislada o fragmento biológicamente activo o equivalente funcional del mismo, o un anticuerpo que se une al mismo.

En otro aspecto amplio, en el presente documento se proporciona un procedimiento de inhibición de la 35 tumorigénesis en un sujeto que tiene cáncer de colon, que comprende:

(1) determinar la cantidad de al menos un producto génico de miR en células cancerosas del sujeto, con respecto a las células control; y

(2) alterar la cantidad del producto génico de miR expresado en las células cancerosas mediante:

(i) administración al sujeto de una cantidad eficaz de al menos un producto génico de miR aislado, seleccionado del grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos, si la cantidad del producto génico de miR expresado en las células cancerosas es inferior a la cantidad del producto

génico de miR expresado en las células control; o (ii) administración al sujeto de una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresión del al menos un producto génico de miR, si la cantidad del producto génico de miR expresado en las células cancerosas es superior a la cantidad del producto génico de miR expresado en las células control,

de modo tal que se inhibe la tumorigénesis en el sujeto.

En un aspecto concreto, el al menos un producto génico de miR aislado en la etapa (1) es miR-21 o una variante aislada o fragmento biológicamente activo del mismo. Asimismo,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para diagnosticar si un sujeto tiene un pronóstico de menor supervivencia de un adenocarcinoma de colon, que comprende medir el nivel de al menos un producto génico de miR-21 en una muestra de ensayo del sujeto en el que un incremento en al menos el nivel del producto génico de miR en la muestra de ensayo con respecto al nivel de un correspondiente producto génico de miR en una muestra control, es indicativo de que el sujeto tiene un mal pronóstico de supervivencia del adenocarcinoma de colon.

2. Un procedimiento de diagnóstico de si un sujeto tiene un pronóstico de menor supervivencia de un 10 adenocarcinoma de colon, que comprende:

(1) determinar un nivel de expresión de al menos un marcador en una muestra de un sujeto de ensayo; incluyendo el al menos un marcador al menos un producto génico de miR-21;

(2) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa (1) con un nivel de expresión control del marcador en 15 una muestra de un sujeto sano; y

(3) juzgar que el sujeto tiene un pronóstico de menor supervivencia de un adenocarcinoma de colon cuando el resultado de la comparación en la etapa (2) indica que:

(i) el nivel de expresión del al menos un marcador en el sujeto de ensayo es mayor que en el control. 20

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la muestra comprende uno o más de tejido, sangre, plasma, suero, orina y heces o en el que todas las etapas del procedimiento se realizan in vitro.

4. El procedimiento de la reivindicación 2, que comprede 25

(1) transcripción inversa de ARN desde una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un grupo de oligodesoxinucleótidos diana;

(2) hibridación de los oligodesoxinucleótidos diana con una micromatriz que comprende sondas

oligonucleotídicas específicas de miRNA-21 para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de 30 ensayo; y

(3) comparación del perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación generado a partir de una muestra control,

en el que un incremento en la señal de al menos el miR-21 es indicativo de que el sujeto tiene un pronóstico de 35 menor supervivencia de un adenocarcinoma de colon.

5. El procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende medir el nivel de uno o más productos génicos de miR adicionales seleccionados del grupo que consiste en miR20a, miR-106a, miR-181b, miR203 y combinaciones de los mismos, en el que un incremento de la señal de uno o más los productos génicos de miR adicionales es indicativo del sujeto que tiene un pronóstico de menor superfivivencia para al adenocarcinoma de colon.

6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que un nivel de expresión del

marcador se evalúa detectando la presencia de un polinucleótido transcrito o una porción del mismo, en el que el 45 polinucleótido transcrito comprende una región de codificación del marcador.

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra (i) es un fluido corporal o un tejido asociados con el cáncer de colon; o 50 (ii) comprende células obtenidas del paciente.

8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el al menos un producto génico miR-21 y combinaciones de los mismos incluyen variantes aisladas o fragmentos biológicamente activos o equivalentes funcionales del mismo o anticuerpos que se unen al mismo.

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Alta basada en mediana

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