Polipéptido coestimulador B7-H5.

Un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico quees idéntico en al menos el 85% a

(a) una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:

1 o SEQ ID NO: 3,

(b) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4; o

(c) una molécula de ácido nucleico que incluye un segmento de al menos 100, 125, 150, 175, 200, 10 250, 300, 350,400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 915, 920, 925, 926, 927, 928, 929, 930, 931, 932 ó 933nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o al menos 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700,750, 800, 850, 900, 910, 915, 920, 925, 926, 927, 928 ó 929 nucleótidos de SEQ ID NO: 4,

para su uso en una terapia de estimulación de respuesta inmunitaria en un mamífero, en el que el polipéptido tienela capacidad de coestimular un linfocito T.

Polipéptido coestimulador B7-H5

REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS

La presente solicitud reivindica el beneficio de la fecha de presentación de la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. nº de serie 60/582.491, presentada el 24 de junio de 2004.

ANTECEDENTES

Los linfocitos T activados desempeñan funciones críticas en la defensa de los hospedadores contra infección vírica y cáncer e intervienen en la evolución de las enfermedades autoinmunitarias. Normalmente se requieren dos señales distintas para la activación óptima de linfocitos T específicos de antígenos. La primera señal 15 es proporcionada por las interacciones del complejo de péptido antigénico y el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) con el receptor de linfocitos T (TCR) . La segunda señal es suministrada a los linfocitos T por moléculas coestimuladoras expresadas en células presentadoras de antígenos (APC) . Los estudios han demostrado que las interacciones coestimuladoras estimulan el desarrollo de linfocitos T, regulan por aumento la producción de citocinas y promueven la diferenciación de linfocitos T. Además, la ligación de moléculas coestimuladoras proporciona una señal de supervivencia esencial para que los linfocitos T prevengan la apoptosis. Además, las señales coestimuladoras parecen ser vitales para la inducción y el mantenimiento de la anergia de los linfocitos T. De forma más importante, existe un claro interés por la manipulación terapéutica de las vías coestimuladoras dado que el control de las señales coestimuladoras puede proporcionar un medio para potenciar o para inhibir las respuestas inmunitarias.

El documento WO-01/04.297-A2 se refiere a proteínas humanas que tienen dominios hidrófobos, ADN que codifican estas proteínas, vectores de expresión para estos ADN, células eucariotas transformadas que expresan estos ADN y anticuerpos dirigidos a estas proteínas. La SEQ ID NO 9 del documento WO-01/04.297-A2 se refiere a una proteína de 311 aminoácidos. El ácido nucleico de codificación se muestra en las SEQ ID NO 19 y 29.

El documento WO-01/04.297-A2 también desvela en general procedimientos de producción recombinante y cribado así como usos médicos para las proteínas desveladas en el documento WO-01/04.297-A2.

DATABASE EMBL [Online] 29 de septiembre de 2000, "Homo sapiens mRNA for FLJ00041 protein, partial cds”, nº de acceso EBI EMBL:AK024449, nº de acceso de base de datos AK024449 desvela un ARNm de homo sapiens de 4.689 ácidos nucleicos y una secuencia de aminoácidos traducida de 330 aminoácidos.

DATABASE EMBL [Online] 8 de febrero de 2001, "Mus musculus 0 day neonate skin DNAc, RIKEN full-lenght enriched librar y , clone:4632428N05 product: hypothetical Inmunoglobulin and major histocompatibility complex domain/Inmunoglobulin subtype containing protein, full insert sequence", nº de acceso EBI EMBL:

AK014600, nº de acceso de base de datos AK014600 desvela un ARNm de ratón de 4.397 ácidos nucleicos y una secuencia de aminoácidos traducida de 309 aminoácidos.

RESUMEN

La invención se basa, en parte, en la clonación de moléculas de ADNc humano y de ratón que codifican moléculas homólogas que coestimulan las respuestas de los linfocitos T de las dos especies y en la caracterización funcional de los polipéptidos que codifican las moléculas de ADNc. El polipéptido humano es designado como hB7-H5 y el polipéptido de ratón mB7-H5. El texto que hace referencia B7-H5 sin especificar si es humano o de ratón es pertinente para las dos formas de B7-H5. La invención presenta los polipéptidos hB7-H5,

mB7-H5, fragmentos funcionales de los polipéptidos, ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos o fragmentos, proteínas de fusión que contienen los polipéptidos o fragmentos funcionales de los polipéptidos y células que expresan los polipéptidos o los fragmentos funcionales para su uso en terapia de estimulación de respuesta inmunitaria en un mamífero. También se incluyen en la invención anticuerpos que se unen a los polipéptidos B7-H5. La invención presenta procedimientos in vitro de coestimulación de respuestas de linfocitos T y procedimientos de 55 cribado para compuestos que modulan las respuestas inmunitarias.

La invención también comprende un polipéptido B7-H5 aislado para su uso en terapia de estimulación de respuesta inmunitaria en un mamífero, por ejemplo, un polipéptido codificado por un ADN que incluye una secuencia de ácidos nucleicos que (i) codifica un polipéptido con la capacidad de coestimular un linfocito T y (ii) se hibrida en condiciones rigurosas al complemento de una secuencia que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. El polipéptido B7-H5 puede incluir una secuencia amino del residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 311 de SEQ ID NO: 1 o el residuo de aminoácido 309 de SEQ ID NO: 3. La invención también comprende polipéptidos B7-H5 que incluyen una secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 1 5 o SEQ ID NO: 3 para su uso en terapia de estimulación de respuesta inmunitaria en un mamífero, o un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos comprende del residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 311 de SEQ ID NO: 1 o del residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 309 de SEQ ID NO: 3 con de 1 a 20 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos, para su uso en terapia de estimulación de respuesta inmunitaria en un mamífero, en el que el polipéptido tiene la capacidad de coestimular un linfocito T. Los polipéptidos de la invención incluyen proteínas de fusión que contienen un primer dominio y al menos un dominio adicional. El primer dominio puede ser cualquiera de los polipéptidos B7-H5 descritos anteriormente. El al menos un dominio adicional puede ser, por ejemplo, una secuencia de guía o de acceso heteróloga, o una secuencia de aminoácidos que facilita la purificación, detección o solubilidad de la proteína de fusión.

Otra forma de realización de la invención es un procedimiento de coestimulación de un linfocito T que implica la puesta en contacto del linfocito T con cualquiera de los polipéptidos B7-H5 de la invención, o proteínas de fusión de la invención; estas 2 clases de molécula son designadas, por comodidad, como "agentes B7-H5”. La puesta en contacto puede ser por cultivo de cualquiera de estos agentes B7-H5 con el linfocito T in vitro. Una puesta en contacto de un linfocito T en un mamífero (por ejemplo, un primate humano o no humano (por ejemplo, un mono) ,

un ratón, una rata, una cobaya, una vaca, una oveja, un caballo, un cerdo, un conejo, un perro o un gato) con cualquiera de los polipéptidos B7-H5 de la invención, o proteínas de fusión de la invención puede ser mediante la administración de cualquiera de los agentes B7-H5 al mamífero o la administración de un ácido nucleico que codifica el agente B7-H5 al mamífero. En un procedimiento ex vivo puede proporcionarse una célula recombinante que es descendiente de una célula obtenida del mamífero y que ha sido transfectada o transformada ex vivo con un ácido nucleico que codifica cualquiera de los agentes B7-H5 de manera que la célula expresa el agente B7-H5 y administrarse al mamífero. En este procedimiento ex vivo, la célula puede ser una célula presentadora de antígeno (APC) que expresa el agente B7-H5 en su superficie. Además, antes de la administración al mamífero, la APC puede ser pulsada con un antígeno o un péptido antigénico. En cualquiera de los procedimientos anteriores, puede sospecharse que el mamífero tiene, por ejemplo, una enfermedad de inmunodeficiencia, una afección inflamatoria o una enfermedad autoinmunitaria. Además, en cualquiera de los procedimientos, el linfocito T puede ser un linfocito T auxiliar, por ejemplo, un linfocito T que ayuda a una respuesta de efector (por ejemplo, un linfocito T citotóxico (CTL)

o un anticuerpo de linfocito B) . Una respuesta de anticuerpo puede ser, por ejemplo, una respuesta de anticuerpo IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE o IgA. La coestimulación de un linfocito T por cualquiera de los agentes B7-H5 puede producir un aumento en el nivel de ligando CD40 en la superficie del linfocito T.

La invención incluye un procedimiento de identificación de un compuesto que modula una respuesta inmunitaria. El procedimiento implica: suministro de un compuesto de prueba; cultivo, conjunto, del compuesto, uno o más agentes B7-H5, un linfocito T y una molécula de activación de linfocito T; y determinación de si el compuesto de prueba modula la respuesta del linfocito T a la molécula, como una indicación de que el compuesto de prueba modula una respuesta inmunitaria. La molécula puede ser, por... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que es idéntico en al menos el 85% a 5

(a) una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3,

(b) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4; o

(c) una molécula de ácido nucleico que incluye un segmento de al menos 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 915, 920, 925, 926, 927, 928, 929, 930, 931, 932 ó 933 nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o al menos 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 915, 920, 925, 926, 927, 928 ó 929 nucleótidos de SEQ ID NO: 4,

para su uso en una terapia de estimulación de respuesta inmunitaria en un mamífero, en el que el polipéptido tiene la capacidad de coestimular un linfocito T.

2. El polipéptido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos comprende:

del residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 311 de SEQ ID NO: 1; o del residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 309 de SEQ ID NO: 3.

3. El polipéptido según la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende:

del residuo de aminoácido 30 al residuo de aminoácido 190, en particular del residuo de aminoácido 47 al residuo de aminoácido 150 de SEQ ID NO: 1; o del residuo de aminoácido 47 al residuo de aminoácido 149 de SEQ ID NO: 3. 30

4. El polipéptido según la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende del residuo de aminoácido 30 al residuo de aminoácido 170 de SEQ ID NO: 1.

5. Una proteína de fusión que comprende:

un primer dominio que comprende el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; y

al menos un dominio adicional,

para su uso en terapia de estimulación de respuesta inmunitaria en un mamífero.

6. La proteína de fusión según la reivindicación 5, en el que el al menos un dominio adicional comprende un marcador, un indicador, una región constante de inmunoglobulina (Ig) , parte de una región constante de Ig, una secuencia de guía o de acceso heteróloga, o una etiqueta que facilita la purificación, detección o solubilidad de la 45 proteína de fusión.

7. La proteína de fusión según la reivindicación 6, en la que la etiqueta es polihistidina.

8. Un procedimiento de coestimulación de un linfocito T, comprendiendo el procedimiento:

la puesta en contacto de un linfocito T in vitro con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 4, o un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos comprende del residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 311 de SEQ ID NO: 1 o del residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 309 de SEQ ID NO: 3 con de 0 a 20 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos, en el que el polipéptido tiene la capacidad de coestimular un 55 linfocito T.

9. Un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos comprende del residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 311 de SEQ ID NO: 1 o del residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 309 de SEQ ID NO: 3 con de 1 a 20 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 4, o un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos comprende del residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 311 de SEQ ID NO: 1 o del residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 309 de SEQ ID NO: 3 con de 0 a 20 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos, para su uso en terapia de estimulación de respuesta inmunitaria en un mamífero, en el que el

polipéptido tiene la capacidad de coestimular un linfocito T.

10. Una célula recombinante para su uso en terapia de estimulación de respuesta inmunitaria en un mamífero, en el que dicha célula recombinante expresa un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 4, o un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos comprende del residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 311 de SEQ ID NO: 1 o del residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 309 de SEQ ID NO: 3 con de 0 a 20 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos, en el que dicha célula recombinante se origina en una célula de dicho mamífero o de la descendencia de esta célula, en la que la célula recombinante comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido,

en la que el polipéptido tiene la capacidad de coestimular un linfocito T, en la que ni dicha célula recombinante ni dicha célula de dicho mamífero ni dicha descendencia de esta célula es una célula madre embrionaria humana.

11. La célula recombinante según la reivindicación 10, en la que la célula es una célula presentadora de antígeno (APC) . 20

12. La célula recombinante según la reivindicación 11, en la que la APC es una APC pulsada con un antígeno, especialmente con un péptido antigénico.

13. Una proteína de fusión para su uso en terapia de estimulación de respuesta inmunitaria en un 25 mamífero, en el que la proteína de fusión comprende:

(a) un primer dominio que comprende SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 con de 0 a 20 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos; y

(b) al menos un dominio adicional.

14. El polipéptido, la célula recombinante o la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 9 a 13 para su uso en el tratamiento de una enfermedad de inmunodeficiencia, una afección inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, inmunosupresión, una afección inducida por virus, una inmunodeficiencia congénita o una función inmunitaria alterada en un mamífero.

15. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que el linfocito T es un linfocito T auxiliar, especialmente un linfocito T auxiliar que ayuda a una respuesta de linfocitos T citotóxicos o anticuerpos de linfocitos B. 40

16. Un procedimiento de identificación de un compuesto que modula una respuesta inmunitaria, comprendiendo el procedimiento:

el suministro de un compuesto de prueba;

el cultivo conjuntamente de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 4, o un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos comprende del residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 311 de SEQ ID NO: 1

o del residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 309 de SEQ ID NO: 3 con de 0 a 20 inserciones,

deleciones o sustituciones de aminoácidos, un linfocito T y una molécula que suministra una señal de activación a un 50 linfocito T; y

la determinación de si el compuesto de prueba modula la respuesta del linfocito T a la molécula, en el que un compuesto de prueba que modula la respuesta del linfocito T a la molécula es un compuesto que modula una respuesta inmunitaria, y en el que el polipéptido tiene la capacidad de coestimular un linfocito T.

17. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que un compuesto de prueba que inhibe la respuesta del linfocito T a la molécula es un compuesto que inhibe una respuesta inmunitaria.

18. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que un compuesto de prueba que potencia la

respuesta del linfocito T a la molécula es un compuesto que potencia una respuesta inmunitaria.

19. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que la molécula es un

anticuerpo que se une a un receptor de linfocitos T o a un polipéptido CD3. 5

20. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que la molécula es un aloantígeno o un péptido antigénico fijado a una molécula de complejo principal de histocompatibilidad (MHC) en la superficie de la célula presentadora de antígeno (APC) .

21. El procedimiento según la reivindicación 20, en el que la APC expresa el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 4, o el polipéptido cuya secuencia de aminoácidos comprende del residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 31 de SEQ ID NO: 1 o del residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 309 de SEQ ID NO: 3 con de 0 a 20 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la superficie del APC.

22. El procedimiento según la reivindicación 21, en el que el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 4, o el polipéptido cuya secuencia de aminoácidos comprende del residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 311 de SEQ ID NO: 1 o del residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 309 de SEQ ID NO: 3 con de 0 a 20 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos se expresa a partir de un ácido nucleico recombinante.

23. El polipéptido, la célula recombinante, o la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9-13 para su uso en terapia de estimulación de respuesta inmunitaria en un mamífero, o el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 16-22, en el que el polipéptido, o el primer dominio de la proteína de fusión es codificado por un ácido nucleico cuya secuencia de ácidos nucleicos es SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 o un segmento de al menos 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 915, 920, 925, 926, 927, 928, 929, 930, 931, 932 ó 933 nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o al menos 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 915, 920, 925, 926, 927, 928 ó 929 nucleótidos de SEQ ID NO: 4.

24. Una formulación farmacéuticamente aceptable que comprende un polipéptido según SEQ ID NO: 1 o según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en una cantidad eficaz para coestimular un linfocito T y un soporte farmacéuticamente aceptable para su uso en terapia de estimulación de respuesta inmunitaria en un mamífero.

25. La formulación según la reivindicación 24, en el que el polipéptido es codificado por un ácido nucleico según SEQ ID NO: 2 ó 4 o un segmento de al menos 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 915, 920, 925, 926, 927, 928, 929, 930, 931, 932 ó 933 nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o al menos 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 910, 915, 920, 925, 926, 927, 928 ó 929 nucleótidos de SEQ ID NO: 4.

26. La formulación según una cualquiera de las reivindicacione.

2. 25 para su uso en el tratamiento de una enfermedad de inmunodeficiencia, una afección inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, inmunosupresión, una afección inducida por virus, una inmunodeficiencia congénita o una función inmunitaria alterada en un mamífero.

27. Un anticuerpo o fragmento de un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos comprende SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 con de 0 a 20 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos para su uso en una terapia de modulación inmunitaria en un mamífero,

en el que el polipéptido tiene la capacidad de coestimular un linfocito T.

28. Un anticuerpo o fragmento de un anticuerpo para su uso en una terapia de modulación inmunitaria en un mamífero, en el que el anticuerpo o fragmento del anticuerpo se une específicamente al polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.