Patrones de lípidos estables novedosos.

Composición de patrón de referencia de lípidos acuosa estable que comprende un constituyente sustancialmente puro seleccionado del grupo que consiste en colesterol total (CHOL),

triglicéridos (TRIG), lipoproteína de baja densidad (LDL), lipoproteína de alta densidad (HDL), apolipoproteína A (APO-A), apolipoproteína B (APO-B), apolipoproteína (a) (Lp(a)) y un subcomponente de una apolipoproteína, y una cantidad de estabilización de ácido 3,3'-tiodipropiónico (TDPA), en la que la cantidad de estabilización oscila entre 1,1 gramos por litro y 18,0 gramos por litro, oscilando el pH de dicha composición entre 6,5 y 9,0.

Patrones de lípidos estables novedosos.

Antecedentes de la invención La determinación de los niveles de lípidos en un líquido corporal, particularmente la determinación de los niveles de colesterol total, lipoproteína de alta densidad (HDL) , lipoproteína de baja densidad (LDL) , triglicéridos, apolipoproteína, fosfolípidos, esfingolípidos y ésteres de colesterilo, denominados colectivamente “lípidos”, ha llegado a tener rápidamente un amplio uso con el reciente desarrollo de procedimientos de determinación enzimáticos, inmunológicos, electroforéticos y de ultracentrifugación. Como resultado, ha estado aumentando la utilidad de estos lípidos en el campo del diagnóstico clínico. Por tanto, se requiere una disolución patrón apropiada para la determinación de los niveles de lípidos.

La mayor parte de análisis de colesterol comprenden mezclar un reactivo de trabajo cromogénico con la muestra que va a analizarse y, tras el desarrollo de color, observar la intensidad de color en un espectrofotómetro. El reactivo de trabajo contiene generalmente colesterol esterasa para convertir ésteres de colesterol en colesterol libre, y colesterol oxidasa para oxidar el colesterol libre produciendo colestenona, liberando simultáneamente peróxido de hidrógeno. La cantidad de colesterol presente se determina entonces midiendo la cantidad de peróxido de hidrógeno liberado usando el sistema peroxidasa/fenol/4-aminoantipirina, también presente en el reactivo de trabajo. Este análisis también se ejecuta con disoluciones de calibrador, que se preparan añadiendo el reactivo de trabajo a disoluciones patrón que contienen concentraciones conocidas de colesterol, de modo que puede obtenerse información cuantitativa significativa.

La mayor parte de análisis de colesterol HDL se realizan mediante ensayos homogéneos sin la necesidad de pretratamiento de etapas de centrifugación. El método depende de un detergente único que solubiliza sólo las partículas de lipoproteína HDL y libera colesterol HDL para reaccionar con el ensayo enzimático descrito anteriormente para producir un producto coloreado. El mismo detergente también inhibe la reacción de las enzimas de colesterol con LDL, lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y lipoproteínas de tipo quilomicrones mediante la adsorción en sus superficies. Además, un polianión contenido en el reactivo potencia la selectividad para colesterol HDL complejando las proteínas LDL, VLDL y quilomicrones (véase el manual de información química de los sistemas Synchron CX de Beckman n.º 249595, mayo de 2000) .

Los análisis de colesterol HDL también se miden mediante un método directo usando enzimas modificadas con polietilenglicol (PEG) y sulfato de dextrano. Cuando se modifican las enzimas colesterol esterasa y colesterol oxidasa mediante PEG, demuestran actividades catalíticas selectivas hacia fracciones de lipoproteínas, aumentando la reactividad en el orden: LDL < VLDL < quilomicrones < HDL. En presencia de iones magnesio, la a-ciclodextrina sulfatada reduce la reactividad del colesterol, especialmente en quilomicrones y VLDL, sin la necesidad de precipitación de agregados de lipoproteínas. (Véase Roche Diagnostics Corporation, GmbH, 2002, n.º 05453101, Mannheim, Alemania) . Esto permite la determinación selectiva de colesterol HDL en suero.

Hasta la fecha, los ensayos de colesterol LDL se han realizado aprovechando la solubilización micelar seleccionada de colesterol LDL mediante un detergente no iónico y la interacción de un compuesto de azúcar con lipoproteínas (VLDL y quilomicrones) . Cuando un detergente está incluido en el método enzimático para la determinación de colesterol, las reactividades relativas de colesterol en las fracciones de lipoproteínas aumentan en este orden: HDL < quilomicrones < VLDL < LDL. En presencia de cationes magnesio, un compuesto de azúcar reduce notablemente la reacción enzimática para la medición de colesterol en VLDL y quilomicrones. La combinación de un compuesto de azúcar con detergente permite la determinación selectiva de colesterol LDL en suero. (Véase Roche Diagnostics Corporation, GmbH, 2002, Publicación técnica n.º 054565801, Mannheim, Alemania) . El colesterol LDL también se determina usando procedimientos descritos en boletines técnicos disponibles de, entre otros, Genzyme Corporation, Beckman Coulter, y similares.

La mayor parte de ensayos de triglicéridos comprenden mezclar un reactivo de trabajo cromogénico con la muestra que va a analizarse y, tras el desarrollo de color, observar la intensidad de color en un espectrofotómetro. El reactivo de trabajo contiene generalmente lipasa para convertir triglicéridos en glicerol y ácidos grasos, seguido por la reacción de glicerol y ATP catalizada por glicerol cinasa para producir glicerol-3-fosfato y ADP. El glicerol-3-fosfato se cataliza entonces con glicerofosfato oxidasa para formar dihidroxiacetona fosfato más peróxido de hidrógeno. La cantidad de triglicéridos presente se determina entonces midiendo la cantidad de color procedente de la reacción de peroxidasa que convierte sustancias cromogénicas tales como 4-aminofenazona y 4-clorofenol o 4-aminoantipirina y ácido 3, 5-dicloro-2-hidroxibencenosulfónico para formar el producto final para la medición fotométrica. Este análisis también se ejecuta con disoluciones de calibrador, que se preparan añadiendo el reactivo de trabajo a disoluciones patrón que contienen concentraciones conocidas de triglicéridos, de modo que puede obtenerse información cuantitativa significativa.

La apolipoproteína A-1 (APO-A1) se mide usando técnicas de ensayo inmunoturbidimétricas en las que se añade muestra a un tampón Tris seguido por la adición de un anticuerpo anti-lipoproteína A-1. Los anticuerpos antilipoproteína A-1 reaccionan con el antígeno en la muestra para formar complejos antígeno/anticuerpo que, tras la aglutinación, se miden de manera turbidimétrica. (Véase Roche Diagnostics Corporation, GmbH, 2002, Publicación técnica n.º 03032612, Mannheim, Alemania) .

La apolipoproteína B (APO-B) se mide a menudo usando técnicas de ensayo inmunoturbidimétricas en las que se añade muestra a un tampón Tris seguido por la adición de un anticuerpo anti-lipoproteína B. Los anticuerpos antilipoproteína B reaccionan con el antígeno en la muestra para formar complejos antígeno/anticuerpo que, tras la aglutinación, se miden de manera turbidimétrica. (Véase Roche Diagnostics Corporation, GmbH, 2002, Publicación técnica n.º 03032639, Mannheim, Alemania) .

Estos procedimientos, ya sean enzimáticos, inmunológicos o turbidimétricos, todos requieren que el reactivo de trabajo, los calibradores, los materiales de control de calidad (QC, quality control) y las muestras sean de una matriz acuosa, tal como, pero sin limitarse a, suero, plasma, y similares. La necesidad de esta matriz específica presenta un problema con respecto a la preparación de disoluciones de calibrador, puesto que el colesterol, y la mayor parte de otros componentes denominados comúnmente “lípidos”, son sustancialmente insolubles en agua. Por ejemplo, una disolución patrón de colesterol preparada en alcohol, que cuando se combina con los reactivos de trabajo acuosos, puede producir precipitación de colesterol. Esto proporciona una disolución de calibrador inaceptable. Tal precipitación puede conducir a un desarrollo de color incierto o incompatible en los materiales de calibrador, QC o verificación de calibración y/o linealidad y generalmente hace que la muestra seleccionada no sirva para correlacionar de manera fiable la intensidad de color con la concentración de colesterol. En un segundo ejemplo, la medición de triglicéridos con un método de referencia usa un patrón de triglicéridos compuesto por trioleína y/o tripalmitina en una matriz de alcohol.

Debido a su hidrofobicidad, los lípidos se disuelven generalmente en un disolvente orgánico. Estas disoluciones pueden usarse entonces en el método de referencia de Abell-Kendall para la determinación de colesterol. En esta técnica, el colesterol solubilizado en disolvente es compatible con la metodología de ensayo. Sin embargo, los lípidos en estas disoluciones patrón difieren en su estado existente y propiedad de fluido de los que se encuentran en suero. De ese modo, la reactividad entre la disolución patrón y el líquido corporal (por ejemplo, suero) difieren, dando como resultado errores en los valores determinados.

Por tanto, el colesterol de lipoproteínas purificado o de suero derivado de animal o ser humano se ha usado como la disolución patrón. Los triglicéridos pueden calibrarse de manera alternativa usando materiales tales como un glicerol soluble en agua artificial, extractos... [Seguir leyendo]

1. Composición de patrón de referencia de lípidos acuosa estable que comprende un constituyente sustancialmente puro seleccionado del grupo que consiste en colesterol total (CHOL) , triglicéridos (TRIG) , lipoproteína de baja densidad (LDL) , lipoproteína de alta densidad (HDL) , apolipoproteína A (APO-A) , apolipoproteína B (APO-B) , apolipoproteína (a) (Lp (a) ) y un subcomponente de una apolipoproteína, y una cantidad de estabilización de ácido 3, 3’-tiodipropiónico (TDPA) , en la que la cantidad de estabilización oscila entre 1, 1 gramos por litro y 18, 0 gramos por litro, oscilando el pH de dicha composición entre 6, 5 y 9, 0.

2. Uso de una composición de patrón de referencia de lípidos acuosa estable que comprende un constituyente sustancialmente puro seleccionado del grupo que consiste en colesterol total (CHOL) , triglicéridos (TRIG) , lipoproteína de baja densidad (LDL) , lipoproteína de alta densidad (HDL) , apolipoproteína A (APO-A) , apolipoproteína B (APO-B) , apolipoproteína (a) (Lp (a) ) y un subcomponente de una apolipoproteína y una cantidad de estabilización de ácido 3, 3’-tiodipropiónico (TDPA) , en el que la cantidad de estabilización oscila entre 1, 1 gramos por litro y 18, 0 gramos por litro, oscilando el pH de dicha composición entre 6, 5 y 9, 0, para al menos uno de calibración, control de calidad, verificación de calibración y evaluación de linealidad.

3. Uso según la reivindicación 2, en el que dicho uso comprende un método manual, semiautomatizado o totalmente automatizado que comprende un instrumento para la medición de dicho constituyente.

4. Composición de referencia según la reivindicación 1, que comprende además un antioxidante seleccionado del grupo que consiste en monotioglicerol, ácido fumárico, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , N-acetil-L-cisteína, Oxyrase™, ácido ascórbico y sal de dodecasodio del ácido fítico.

5. Composición de referencia según la reivindicación 1, en la que dicho subcomponente es al menos un subcomponente seleccionado del grupo que consiste en All, AIV, B-48, B-100, CI, CII, CIII, D, E1, E2, E3, E4, E5, E6, F, G, H y J.

6. Composición de referencia según la reivindicación 1, en la que dicho valor de CHOL oscila entre 0 y 5000 mg/dl.

7. Composición de referencia según la reivindicación 1, en la que dicho valor de triglicéridos oscila entre 0 y 4000 mg/dl.

8. Composición de referencia según la reivindicación 1, en la que dicho valor de LDL oscila entre 0 y 5000 mg/dl.

9. Composición de referencia según la reivindicación 1, en la que dicho valor de HDL oscila entre 0 y 1000 mg/dl.

10. Composición de referencia según la reivindicación 1, en la que dicho valor de APO-A oscila entre 0 y 1000 mg/dl.

11. Composición de referencia según la reivindicación 1, en la que dicho valor de APO-B oscila entre 0 y 1000 mg/dl.

12. Composición de referencia según la reivindicación 1, en la que dicho valor de Lp (a) oscila entre 0 y 1200 mg/dl.

13. Composición de referencia según la reivindicación 1, en la que dicho valor de dicho subcomponente oscila entre 0 y 500 mg/dl.

14. Composición de referencia según la reivindicación 1, comprendiendo además dicha composición un tampón que comprende ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N-2-etanosulfónico (HEPES) de manera que el pH de dicha composición oscila entre 6, 5 y 8, 0.

15. Composición de referencia según la reivindicación 1, que comprende además un tampón seleccionado del grupo que consiste en:

un tampón que comprende ácido N, N-bis (2-hidroxietil) -2-aminoetanosulfónico (BES) de manera que el pH de dicha composición oscila entre 6, 8 y 8, 3;

un tampón que comprende ácido 3- (N-morfolino) propanosulfónico (MOPS) de manera que el pH de dicha composición oscila entre 6, 8 y 8, 3;

un tampón que comprende ácido N-[tris (hidroximetil) metil]-2-aminoetanosulfónico (TES) de manera que el pH de dicha composición oscila entre 6, 8 y 8, 3;

un tampón que comprende tris (hidroximetil) aminometano (TRIS) de manera que el pH de dicha composición oscila entre 6, 8 y 8, 3; y

un tampón que comprende tampón fosfato de Sorenson de manera que el pH de dicha composición oscila entre 6, 8 y 8, 3.

16. Composición de referencia según la reivindicación 1, comprendiendo además dicha composición una cantidad de azida de sodio de menos del 0, 09% (peso/volumen) .

17. Composición de patrón de calibración o control estable que comprende una cantidad de estabilización de ácido 3, 3’-tiodipropiónico, en la que la cantidad de estabilización oscila entre 1, 1 gramos por litro y 18, 0 gramos por litro, comprendiendo además dicha composición un contenido predeterminado de analito sustancialmente puro seleccionado del grupo que consiste en colesterol total (CHOL) , triglicéridos (TRIG) , lipoproteína de baja densidad (LDL) , lipoproteína de alta densidad (HDL) , apolipoproteína A (APO-A) , apolipoproteína B (APO-B) , Lp (a) y un subcomponente de una apolipoproteína.

18. Método para producir la composición de referencia según la reivindicación 1, comprendiendo dicho método mezclar un líquido que comprende agua, con un valor conocido de un analito sustancialmente puro seleccionado del grupo que consiste en colesterol total (CHOL) , triglicéridos (TRIG) , lipoproteína de baja densidad (LDL) , lipoproteína de alta densidad (HDL) , apolipoproteína A (APO-A) , apolipoproteína B (APO-B) , Lp (a) y un subcomponente de una apolipoproteína, para producir una mezcla y añadir además una cantidad de estabilización de ácido 3, 3’-tiodipropiónico a dicha mezcla, en el que la cantidad de estabilización oscila entre 1, 1 gramos por litro y 18, 0 gramos por litro.

19. Método para producir una composición de patrón de calibración o control estable, comprendiendo dicho método mezclar una disolución acuosa con una cantidad de estabilización de ácido 3, 3’-tiodipropiónico, en el que la cantidad de estabilización oscila entre 1, 1 gramos por litro y 18, 0 gramos por litro, y que comprende además añadir una cantidad predeterminada de un analito esencialmente puro, en el que dicho analito es al menos un analito seleccionado del grupo que consiste en colesterol total (CHOL) , triglicéridos (TRIG) , lipoproteína de baja densidad (LDL) , lipoproteína de alta densidad (HDL) , apolipoproteína A (APO-A) , apolipoproteína B (APO-B) , Lp (a) y un subcomponente de una apolipoproteína.

20. Método según la reivindicación 19, en el que dicha disolución acuosa se selecciona del grupo que consiste en agua, plasma, suero, una disolución que comprende albúmina sérica bovina, una disolución que comprende albúmina sérica humana y una disolución que comprende un tampón de Good.

21. Método según la reivindicación 19, comprendiendo dicho método además añadir a dicha mezcla un antimicrobiano.

22. Método para calibración, control de calidad, verificación de calibración o evaluación de linealidad de un instrumento en el que dicho instrumento está adaptado para determinar una cantidad de un analito seleccionado del grupo que consiste en colesterol total (CHOL) , triglicéridos (TRIG) , lipoproteína de baja densidad (LDL) , lipoproteína de alta densidad (HDL) , apolipoproteína A (APO-A) , apolipoproteína B (APO-B) , Lp (a) y un subcomponente de una apolipoproteína en una disolución de prueba, comprendiendo dicho método someter dicho instrumento a calibración, control de calidad, verificación de calibración o evaluación de linealidad con la composición de referencia según la reivindicación 1.

23. Kit para calibración, control de calidad, verificación de calibración o evaluación de linealidad de un instrumento adaptado para determinar la cantidad de un analito seleccionado del grupo que consiste en colesterol total (CHOL) , triglicéridos (TRIG) , lipoproteína de baja densidad (LDL) , lipoproteína de alta densidad (HDL) , apolipoproteína A (APO-A) , apolipoproteína B (APO-B) , Lp (a) y un subcomponente de una apolipoproteína en una disolución de prueba, comprendiendo dicho kit una composición que comprende una cantidad conocida de dicho analito y una cantidad de estabilización de ácido 3, 3’-tiodipropiónico, en el que la cantidad de estabilización oscila entre 1, 1 gramos por litro y 18, 0 gramos por litro, comprendiendo además dicho kit un aplicador y un material con instrucciones para el uso de dicho kit.

24. Kit según la reivindicación 23, en el que dicho kit comprende al menos una composición seleccionada del grupo que consiste en:

a) una composición que comprende 10 mg/dl de colesterol total, 5 mg/dl de HDL, sin triglicéridos, 5 mg/dl de LDL, 15, 6 mg/dl de APO-A y 3, 3 mg/dl de APO-B;

b) una composición que comprende 200 mg/dl de colesterol total, 37, 5 mg/dl de HDL, 250 mg/dl de triglicéridos, 162, 5 mg/dl de LDL, 117, 2 mg/dl de APO-A y 106, 9 mg/dl de APO-B;

c) una composición que comprende 400 mg/dl de colesterol total, 115 mg/dl de HDL, 500 mg/dl de triglicéridos, 285 mg/dl de LDL, 359, 4 mg/dl de APO-A y 187, 5 mg/dl de APO-B;

d) una composición que comprende 600 mg/dl de colesterol total, 177, 5 mg/dl de HDL, 750 mg/dl de triglicéridos, 422, 5 mg/dl de LDL, 554, 7 mg/dl de APO-A y 287, 0 mg/dl de APO-B; y

e) una composición que comprende 800 mg/dl de colesterol total, 200 mg/dl de HDL, 1000 mg/dl de triglicéridos, 600 mg/dl de LDL, 625 mg/dl de APO-A y 394, 7 mg/dl de APO-B.

25. Kit según la reivindicación 23, en el que dicho kit comprende al menos una composición seleccionada del grupo que consiste en:

a) una composición que no comprende ninguno de colesterol total, HDL, triglicéridos, LDL, APO-A y APO-B; y

b) una composición que comprende 200 mg/dl de colesterol total, 60 mg/dl de HDL, 250 mg/dl de triglicéridos, 140 mg/dl de LDL, 188 mg/dl de APO-A y 92 mg/dl de APO-B.

26. Kit según la reivindicación 23, en el que dicho kit comprende al menos una composición seleccionada del grupo que consiste en:

a) una composición que comprende 100 mg/dl de colesterol total, 20 mg/dl de HDL, 90 mg/dl de triglicéridos, 80 mg/dl de LDL, 63 mg/dl de APO-A y 53 mg/dl de APO-B;

b) una composición que comprende 250 mg/dl de colesterol total, 50 mg/dl de HDL, 150 mg/dl de triglicéridos, 200 mg/dl de LDL, 156 mg/dl de APO-A y 132 mg/dl de APO-B; y

c) una composición que comprende 500 mg/dl de colesterol total, 100 mg/dl de HDL, 250 mg/dl de triglicéridos, 400 mg/dl de LDL, 313 mg/dl de APO-A y 263 mg/dl de APO-B.

27. Kit según la reivindicación 23, en el que dicho kit comprende al menos una composición seleccionada del grupo que consiste en:

a) una composición que comprende 100 mg/dl de colesterol total, 25 mg/dl de HDL, 50 mg/dl de triglicéridos, 75 mg/dl de LDL, 78 mg/dl de APO-A y 49 mg/dl de APO-B;

b) una composición que comprende 275 mg/dl de colesterol total, 48, 75 mg/dl de HDL, 287, 5 mg/dl de triglicéridos, 226, 25 mg/dl de LDL, 152, 25 mg/dl de APO-A y 150 mg/dl de APO-B;

c) una composición que comprende 450 mg/dl de colesterol total, 72, 5 mg/dl de HDL, 525 mg/dl de triglicéridos, 377, 5 mg/dl de LDL, 226, 5 mg/dl de APO-A y 251 mg/dl de APO-B;

d) una composición que comprende 625 mg/dl de colesterol total, 96, 25 mg/dl de HDL, 762, 5 mg/dl de triglicéridos, 528, 75 mg/dl de LDL, 300, 75 mg/dl de APO-A y 352 mg/dl de APO-B; y

e) una composición que comprende 800 mg/dl de colesterol total, 120 mg/dl de HDL, 1000 mg/dl de triglicéridos, 680 mg/dl de LDL, 375 mg/dl de APO-A y 453 mg/dl de APO-B.

28. Kit según la reivindicación 23, en el que dicho kit comprende al menos una composición seleccionada del grupo que consiste en:

a) una composición que no comprende ninguno de colesterol total, HDL, triglicéridos, LDL, APO-A y APO-B; y

b) una composición que comprende más de 240 mg/dl de colesterol total, menos de 35 mg/dl de HDL, 100 mg/dl de triglicéridos, más de 190 mg/dl de LDL, más de 120 mg/dl de APO-A y menos de 120 mg/dl de APO-B.

29. Kit según la reivindicación 23, en el que dicho kit comprende al menos una composición seleccionada del grupo que consiste en:

a) una composición que no comprende ninguno de colesterol total, HDL, triglicéridos, LDL, APO-A y APO-B; y

b) una composición que comprende más de 240 mg/dl de colesterol total, menos de 45 mg/dl de HDL, 100 mg/dl de triglicéridos, más de 190 mg/dl de LDL, más de 120 mg/dl de APO-A y menos de 120 mg/dl de APO-B.