Procedimiento para oxidar material lignocelulósico empleando una peroxidasa de Marasmius scorodonius.

Un método para la oxidación de un material lignocelulósico, método el cual comprende poner en contacto dicho material lignocelulósico con un polipéptido que tiene actividad de peroxidasa y que es:

a. un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 55% de homología con una secuencia de aminoácidos expuesta en uno cualquiera de: aminoácidos 21 a 513 de SEC NO: 2; aminoácidos 20 a 510 de SEC ID NO: 4; aminoácidos 1 a 493 de SEC ID NO 6; o aminoácidos 1 a 491 de SEC ID NO: 8, o

b. un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica que tiene al menos 55% de homología con la secuencia nucleotídica expuesta en uno cualquiera de: nucleótidos 61 a 1539 de SEC ID NO: 1; nucleótidos 58 a 1530 de SEC ID NO: 3; nucleótidos 1 a 1479 de SEC ID NO: 5; o nucleótidos 1 a 1473 de SEC ID NO: 7.

Procedimiento para oxidar material lignocelulósico empleando una peroxidasa de Marasmius scorodonius Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos para la oxidación de un material lignocelulósico que comprende un material de hidrato de carbono que no es almidón, para incrementar la susceptibilidad de tal material a la degradación enzimática, para la degradación de tal material y para producir un azúcar o azúcares a partir de tal material usando enzimas peroxidasas. La invención también se refiere al uso de enzimas peroxidasas en tales métodos.

Antecedentes de la invención Los hidratos de carbono constituyen los compuestos orgánicos más abundantes en la tierra. Sin embargo, mucho de este hidrato de carbono está secuestrado en polímeros complejos que incluyen almidón (el principal hidrato de carbono de almacenamiento en semillas y granos) , y una colección de hidratos de carbono y lignina conocida como lignocelulosa. Los componentes principales de hidratos de carbono de lignocelulosa son celulosa, hemicelulosa, y pectinas. Estos polímeros complejos se denominan a menudo de forma colectiva como lignocelulosa.

La bioconversión de biomasa lignocelulósica renovable en un azúcar fermentable que se fermenta subsiguientemente para producir alcohol (por ejemplo, etanol) como alternativa a combustibles líquidos ha atraído una intensa atención de los investigadores desde los años 1970, cuando la crisis del petróleo estalló debido a la disminución de la producción de petróleo por la OPEP. El etanol se ha usado ampliamente como una mezcla al 10% con gasolina en los Estados Unidos de América, o como combustible puro para vehículos en Brasil en las dos últimas décadas. Más recientemente, el uso de E85, una mezcla de etanol al 85% se ha implementado especialmente para aplicaciones de limpieza de la ciudad. La importancia del combustible bioetanol aumentará paralelamente al aumento de los precios del petróleo y el agotamiento gradual de sus fuentes. Adicionalmente, los azúcares fermentables están siendo usados para producir plásticos, polímeros y otros productos a base de fuentes biológicas, y se espera que esta industria crezca sustancialmente incrementando por lo tanto la demanda de azúcares fermentables de bajo coste abundantes que se puedan usar como materia prima en lugar de materias primas a base de petróleo.

El secuestro de tales grandes cantidades de hidratos de carbono en biomasa vegetal proporciona una fuente abundante de energía potencial en forma de azúcares, tanto azúcares de cinco carbonos como de seis carbonos, que se podrían utilizar para numerosos procesos industriales y agrícolas. Sin embargo, el enorme potencial energético de estos hidratos de carbono está actualmente siendo infrautilizado debido a que los azúcares están bloqueados en polímeros complejos, y por tanto no son fácilmente accesibles para la fermentación. Los métodos que generen azúcares a partir de biomasa vegetal proporcionarían materias primas abundantes, económicamente competitivas, para la fermentación en compuestos químicos, plásticos y combustibles.

A pesar de la investigación continua de las últimas décadas recientes por comprender la degradación enzimática de la biomasa lignocelulósica y la producción enzimática de celulasas, todavía sigue siendo deseable descubrir o manipular mediante ingeniería nuevas celulasas y hemicelulasas muy activas. También sería muy deseable construir composiciones enzimáticas muy eficientes capaces de llevar a cabo una degradación rápida y eficiente de materiales lignocelulósicos.

Además, típicamente se usan procedimientos quimiomecánicos para liberar la celulosa para la conversión subsiguiente en azúcares fermentables. Tales procedimientos quimiomecánicos requieren vasijas de reacción caras y son energéticamente costosas. Además, el pretratamiento químico que se produce a temperaturas elevadas y en condiciones extremas de pH no son compatibles con enzimas conocidas que degradan la celulosa. Adicionalmente, estas reacciones producen compuestos que se deben eliminar antes de que pueda transcurrir la fermentación. Como resultado, los procedimientos de pretratamiento químico actualmente se producen en vasijas de reacción distintas de la degradación de la celulosa, y se deben de producir antes de la degradación de la celulosa.

El documento US 5.865.898 A describe un método para oxidar un material lignocelulósico, método el cual comprende poner en contacto dicho material lignocelulósico con un agente oxidante seleccionado de oxígeno y gases que contienen oxígeno.

De este modo, son deseables los métodos que son más compatibles con el procedimiento de degradación de la celulosa, que no requieren temperatura y presión elevadas, que no generan productos de desecho tóxicos y que requieren menos energía.

Sumario de la invención Se ha demostrado que las peroxidasas de Marasmius scorodonius pueden ayudar a las celulasas para liberar mayores cantidades de azúcar a partir de materia prima lignocelulósica que lo que sería el caso en ausencia de dichas peroxidasas.

Según la invención, se proporciona así un método para la oxidación de un material lignocelulósico que comprende un hidrato de carbono que no es almidón, método el cual comprende poner en contacto dicho material lignocelulósico que comprende un hidrato de carbono que no es almidón con un polipéptido que tiene actividad de peroxidasa y que es:

a. un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 55% de homología con una secuencia de aminoácidos expuesta en uno cualquiera de: aminoácidos 21 a 513 de SEC NO: 2; aminoácidos 20 a 510 de SEC ID NO: 4; aminoácidos 1 a 493 de SEC ID NO 6; o aminoácidos 1 a 491 de SEC ID NO: 8, o b. un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica que tiene al

menos 55% de homología con la secuencia nucleotídica expuesta en uno cualquiera de: nucleótidos 61 a 1539 de SEC ID NO: 1; nucleótidos 58 a 1530 de SEC ID NO: 3; nucleótidos 1 a 1479 de SEC ID NO: 5; o nucleótidos 1 a 1473 de SEC ID NO: 7,

para oxidar de ese modo dicho material lignocelulósico que comprende un hidrato de carbono que no es almidón.

La invención también proporciona:

- un método para incrementar la susceptibilidad de un material lignocelulósico que comprende un hidrato de carbono que no es almidón a la degradación enzimática, método el cual comprende poner en contacto dicho material lignocelulósico que comprende un hidrato de carbono que no es almidón con un polipéptido que tiene actividad de peroxidasa y que es:

a. un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 55% de homología con una secuencia de aminoácidos expuesta en uno cualquiera de: aminoácidos 21 a 513 de SEC NO: 2; aminoácidos 20 a 510 de SEC ID NO: 4; aminoácidos 1 a 493 de SEC ID NO 6; o aminoácidos 1 a 491 de SEC ID NO: 8, o b. un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica que tiene al menos 55% de homología con la secuencia nucleotídica expuesta en uno cualquiera de: nucleótidos 61 a 1539 de SEC ID NO: 1; nucleótidos 58 a 1530 de SEC ID NO: 3; nucleótidos 1 a 1479 de SEC ID NO: 5; o nucleótidos 1 a 1473 de SEC ID NO: 7,

para incrementar de ese modo la susceptibilidad de un material lignocelulósico que comprende un hidrato de carbono que no es almidón a la degradación enzimática;

-un método para producir un azúcar o azúcares a partir de un material lignocelulósico que comprende un 30 hidrato de carbono que no es almidón, método el cual comprende:

(i) oxidar dicho material lignocelulósico que comprende un hidrato de carbono que no es almidón, o incrementar la susceptibilidad de dicho material lignocelulósico que comprende un hidrato de carbono que no es almidón a la degradación enzimática usando un método como se describe anteriormente; y

(ii) poner en contacto el material lignocelulósico así modificado que comprende un hidrato de carbono 35 que no es almidón con una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa,

para producir de ese modo un azúcar o azúcares a partir de un material lignocelulósico que comprende un hidrato de carbono que no es almidón; y

-un método para producir un azúcar o azúcares a partir de un material lignocelulósico que comprende un hidrato de carbono que no es almidón, método el cual comprende poner en contacto dicho material 40 lignocelulósico que comprende un hidrato de carbono que no es almidón con:

(i) un polipéptido que tiene actividad de peroxidasa y que es:

a. un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene... [Seguir leyendo]

1. Un método para la oxidación de un material lignocelulósico, método el cual comprende poner en contacto dicho material lignocelulósico con un polipéptido que tiene actividad de peroxidasa y que es:

a. un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 55% de homología con una secuencia de aminoácidos expuesta en uno cualquiera de: aminoácidos 21 a 513 de SEC NO: 2; aminoácidos 20 a 510 de SEC ID NO: 4; aminoácidos 1 a 493 de SEC ID NO 6; o aminoácidos 1 a 491 de SEC ID NO: 8, o

b. un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica que tiene al menos 55% de homología con la secuencia nucleotídica expuesta en uno cualquiera de: nucleótidos 61 a 1539 de SEC ID NO: 1; nucleótidos 58 a 1530 de SEC ID NO: 3; nucleótidos 1 a 1479 de SEC ID NO: 5; o nucleótidos 1 a 1473 de SEC ID NO: 7.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que la oxidación aumenta la susceptibilidad del material lignocelulósico a la degradación enzimática.

3. Un método para la producción de un azúcar o azúcares a partir de un material lignocelulósico, método el cual comprende las siguientes etapas:

(i) pretratamiento del material lignocelulósico;

(ii) oxidación de dicho material lignocelulósico usando un método según la reivindicación 1 ó 2; y

(iii) poner en contacto el material lignocelulósico así modificado con una o más celulasas y/o una o más hemicelulasas y/o una o más pectinasas.

4. Un método según la reivindicación 3, en el que el polipéptido que tiene actividad de peroxidasa se pone en contacto con el material que comprende un hidrato de carbono que no es almidón durante, antes de, o después de la etapa de pretratamiento.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido que tiene actividad de peroxidasa se pone en contacto con el material lignocelulósico en combinación con una enzima auxiliar, enzima auxiliar la cual modifica además dicho material que comprende un hidrato de carbono que no es almidón o incrementa la susceptibilidad de dicho material que comprende un hidrato de carbono que no es almidón a la degradación enzimática, en el que la enzima auxiliar es una enzima de las clases: amilasas, proteasas, lipasas, glucuronidasas u oxidorreductasas.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido que tiene actividad de peroxidasa es codificado por un polinucleótido obtenible de Marasmius scorodonius.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el material lignocelulósico es una preparación de huertos de árboles frutales, matorral, desecho de la industria maderera, desecho maderero urbano, desecho municipal, desecho de explotación de la madera, maderas de pequeño calibre, cultivos leñosos de corta rotación, desecho industrial, paja de trigo, paja de avena, paja de arroz, paja de cebada, paja de centeno, paja de cáñamo, vainas de soja, vainas de arroz, paja de arroz, alimento a base de gluten de maíz, vainas de avena, caña de azúcar, rastrojo de maíz, tallos de maíz, mazorcas de maíz, cáscaras de maíz, hierba de pradera, hierba grama, panizo, pulpa de remolacha azucarera, pulpa de frutos cítricos, cáscaras de semillas, desechos celulósicos de animales, recortes de césped, algodón, algas, árboles, arbustos, hierbas, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, maíz, cáscaras de maíz, mazorcas de maíz, pepita de maíz, fibras procedentes de pepitas, productos y subproductos de la molienda húmeda y seca de granos, residuos sólidos municipales, papel residual, desecho de estercoleros, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos de silvicultura, residuos sólidos municipales, papel residual, pasta papelera, residuos de la molienda del papel, ramas, arbustos, cañas, maíz, cáscaras de maíz, un cultivo energético, bosque, una fruta, una flor, un grano, una hierba, un cultivo herbáceo, una hoja, corteza, una aguja, un tronco, una raíz, un retoño, un arbusto, pasto varilla, un árbol, un vegetal, piel de fruta, una vid, pulpa de caña de azúcar, salvado de trigo, vainas de avena, madera dura o blanda, material de desecho orgánico generado a partir de un proceso industrial o desecho maderero de silvicultura, o una combinación de dos cualquiera o más de los mismos.

8. Un método para la preparación de un producto de fermentación, método el cual comprende:

a. tratar un material lignocelulósico según un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, y

b. fermentar el material resultante,

9. Un método según la reivindicación 8, en el que el producto de fermentación es etanol, butanol; ácido láctico, ácido

para preparar de ese modo un producto de fermentación.

3. hidroxi-propiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, ácido itacónico, un aminoácido, 1, 3-propano-diol, etileno, glicerol, un antibiótico ∀-lactámico o una cefalosporina.