Organismos clostridium atenuados y vacuna recombinante.

Una molecula de acido nucleico que codifica una muteina sustancialmente no toxica de la toxina alfa deClostridium perfringens,

en la que la muteina de la toxina alfa comprende la secuencia de aminoacidos de la SEC IDNo: 3 menos 9 restos de aminoacidos consecutivos que van de Tyr62 a Trp70.

Organismos Clostridium atenuados y vacuna recombinante

Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas Esta solicitud es una solicitud no provisional que reivindica la prioridad según el Punto 119 (e) del Título 35 del Código de los Estados Unidos de la solicitud provisional de los Estados Unidos con Nº de Serie 60/792.553, presentada el 7 de abril de 2006.

Campo de la invención Esta invención está relacionada con organismos Clostridium atenuados, a los procedimientos para prepararlos y utilizarlos y a las muteínas de las toxinas alfa y los ácidos nucleicos que la codifican.

Antecedente de la invención Los patógenos bacterianos anaerobios constituyen una grave carga económica en la industria agrícola. Las bacterias de la familia Clostridium representan una carga concreta, debido a que estas bacterias producen graves enfermedades en las aves y otros animales domésticos económicamente valiosos. Los diversos esfuerzos para controlar estos organismos se han basado en las medidas sanitarias y en la administración de antibióticos en la alimentación de los animales.

En particular, Clostridium perfringens (“C. perfringens”) es una bacteria anaerobia que se encuentra en el suelo, en materia orgánica podrida, y como parte de la flora del intestino de seres humanos y animales. Las diferentes cepas de C. perfringens se designan como los biotipos A a E, dependiendo del espectro de toxinas producidas [Justin y col., Biochemistr y 41, 6253-6262 (2002) ; McDonel (1986) PHARMACOLOGY OF BACTERIAL TOXINS; F Domer y J Drews (Eds.) Pergamon Press, Oxford]. Las cepas del biotipo A son de particular importancia como los agentes etiológicos de diversos tipos de gangrena y enfermedades entéricas. Una enfermedad entérica particularmente grave producida por C. perfringens es la enteritis necrosante (conocida también en la técnica como “enteritis necrótica”, una gangrena de los intestinos que da como resultado necrosis, sepsia, y hemolisis, en seres humanos y animales domesticados [véanse, Pearson y coI., J. Am. Vet. Med. 188 (11) :1309-10 (1986) ; AI-Sheikhy y Truscott, Avian Dis. 21 (2) : 256-63 (1977) ]. En aves, por ejemplo, pollos (Gallus gallus) , la enteritis necrosante es un problema significativo. C. perfringens tanto de tipo A como de tipo C puede producir pérdidas importantes, especialmente en la producción de pollos de la variedad Broiler [Ficken y Wages, Necrotic Enteritis, en Diseases of Poultr y , 10ª Ed. pps 261-264 (1997) ]. Además de las pérdidas asociadas con los brotes producidos por enteritis necrosante, se ha notificado que la productividad se ve afectada en bandadas con enfermedades asociadas a C. perfringens [Lovl y Kaldhusdal, Avian Pathology 30:73-81 (2001) ]. Tal como se ha señalado anteriormente, los agentes antibacterianos administrados en la alimentación del animal constituyen el procedimiento de control más común. Sin embargo, los agentes antibacterianos, por ejemplo, los antibióticos, son costosos y están sujetos a riesgos crecientes relacionados con la promoción de la resistencia bacteriana.

De forma más reciente, se han llevado a cabo intentos para proporcionar vacunas contra las especies de Clostridium perjudiciales. Por ejemplo Lovland, y col. [Avian Pathology 33 (1) : 83-92 (2004) ] han ejemplificado vacunas 45 candidatas basadas en los toxoides de tipo A y tipo C de C. perfringens con un adyuvante de hidróxido de aluminio. Se ha notificado la vacunación de gallinas reproductoras para proporcionar anticuerpos específicos para proteger a la progenie frente a las lesiones entéricas inducidas por un estímulo subclínico de C. perfringens. Se conocen otras vacunas basadas en toxoides preparadas a partir de toxinas de C. perfringens detoxificado [véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 4.292.307, que describe toxoides de los tipos A, B y D de C. perfringens, C. oedematiens, y C. septicum].

Se han propuesto también preparaciones de toxoides recombinantes. Por ejemplo, Titball y col., [Patentes de los Estados Unidos Nos 5.851.827, 6.403.094, y 5.817.317] han notificado ácidos nucleicos que codifican péptidos antigénicos de C. perfringens, así como los propios péptidos, y las vacunas preparadas a partir de los péptidos. Se 55 describe que los péptidos tienen, por ejemplo, de 261 a 300 restos de aminoácidos de la toxina alfa de C. perfringens natural, pero carecen de los dominios hidrolizantes de la fosfolipasa C y la esfingomielina de la toxina natural. Se ha notificado además que estos péptidos inducen la inmunoprotección frente a la toxina natural. Además, la Patente de los Estados Unidos Nº 6.610.300 describe una vacuna basada en un fragmento antigénico de una muteína de la toxina beta de C. perfringens.

Sin embargo, no importa si una vacuna de toxoide se deriva del organismo nativo o se obtiene de forma recombinante, se considera que es económicamente laborioso producir y administrar proteínas de toxoides a los animales que necesitan la inmunización, excepto en circunstancias especiales (por ejemplo, para tratar seres humanos que pueden ser alérgicos o sensibles a otros componentes de una vacuna de un organismo completo) .

Además, las vacunas basadas en proteína/toxoide requieren normalmente repetidas vacunaciones de refuerzo con el fin de mantener una completa efectividad.

Otra solución propuesta ha sido construir mediante ingeniería genética un virus antigénicamente activo que produzca una muteína de la toxina alfa, en lugar de la toxina natural. Por ejemplo, Bennett y col. [Viral lmmunol. 12 (2) : 97-105 (1999) ] han ejemplarizado un vector de virus vaccinia recombinante que expresa un codominio no tóxico de la toxina alfa de C. perfringens. Desafortunadamente, aunque se han propuesto algunas vacunas de vaccinia recombinantes durante los últimos 20 años, sigue existiendo desde hace muchos años una preocupación acerca de la seguridad de la administración de virus de vaccinia vivos e infecciosos en un entorno en el que pueden transmitirse a las personas no son resistentes a este virus.

Se sabe que la toxina alfa (gen plc) de C. perfringens posee algunas actividades biológicas que incluyen la actividad hemolítica, de fosfolipasa C, de esfingomielasa, de fosfodiesterasa, y actividades letales. Existen numerosos informes en la técnica que hacen referencia a mutaciones de esta toxina alfa que reducen la toxicidad. Schoepe, y col. [Infect. and Immun. 69 (11) : 7194-7196 (2001) ] describen una cepa de C. perfringens natural que produce una toxina alfa no tóxica. Sin embargo, sería difícil modificar esta cepa para estimular la inmunoprotección frente a otra variante de la especie C. perfringens natural, pero tóxica.

Williamson y Titball [Vaccine 11 (12) : 1253-1258 (1993) ] mostraron que la región de la toxina procedente de los restos de aminoácidos 247 a 370 en solitario fue suficiente para inmunizara ratones contra la gangrena gaseosa inducida experimentalmente por C. perfringens. Alape-Giron y col. [Eur. J. Biochem. 267: 5191-5197 (2000) ] han notificado que las sustituciones en Asp269, Asp336, Tyr275, Tyr307, y Tyr331 redujeron la toxicidad de la toxina alfa. Nagahama, y col. [Infect. and Immun. 65: 3489-3492 (1997) ] notificaron que la sustitución de Asp-56, Asp-130,

o Glu-152 dio como resultado una reducción en la toxicidad de la toxina alfa. Nagahama y col. [J. Bacteriology 177:1179-1185 (1995) ] notificaron que la sustitución de la histidina en la posición 68 por un aminoácido neutro, tal como glicina, en la toxina alfa de C. perfringens, dio como resultado una pérdida completa de la actividad hemolítica, de fosfolipasa C, de esfingomielinasa, y la actividad letal de la muteína de la toxina alfa. Se cree que este único cambio de aminoácidos inactiva uno de los tres dominios de unión al cinc de la proteína. El dominio de unión al cinc inactivado mediante la sustitución de His68 fue posteriormente denotado como Zn2 [Justin y coI., Biochemistr y 41: 6253-6262 (2002) ].

Schoepe y col, Anaerobe, Londres, GB, vol. 12, nº 1, febrero de 2006, páginas 44-48 se refieren a la protección de ratones contra la toxina alfa de Clostridium perfringens mediante la inmunización con la variante 121A191-R212H de una toxina alfa.

A pesar de lo anterior, sigue existiendo una necesidad en la técnica de un procedimiento seguro, económico y eficaz para proteger animales domésticos criados de forma intensiva, que incluyen aves, tales como pollos, de la infección por especies de Clostridium, incluyendo C. perfringens.

La cita de cualquier referencia en el presente documento no debe considerarse como una admisión de que dicha referencia está disponible como “técnica anterior” con respecto a la presente solicitud.

Resumen Con el fin de abordar... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico que codifica una muteína sustancialmente no tóxica de la toxina alfa de Clostridium perfringens, en la que la muteína de la toxina alfa comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 5 Nº: 3 menos 9 restos de aminoácidos consecutivos que van de Tyr62 a Trp70.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico codifica una muteína en la que dichos nueve aminoácidos consecutivos eliminados están sustituidos dichos por un único resto de leucina.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 2, en la que están eliminados los nucleótido.

28. 294 de la molécula de ácido nucleico.

4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3, en la que los nucleótidos eliminados están sustituidos por 15 una secuencia de nucleótidos que codifica un único resto de Leu.

5. Una muteína sustancialmente no tóxica de la toxina alfa de Clostridium perfringens, en la que la muteína de la toxina alfa comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3 menos nueve restos de aminoácidos consecutivos que van de Tyr62 a Trp70.

6. La muteína sustancialmente no tóxica de la toxina alfa de Clostridium perfringens de la reivindicación 5, en la que dichos nueve restos de aminoácidos consecutivos están eliminados y sustituidos por un único resto de Leu.

7. Un organismo Clostridium perfringens atenuado sustancialmente no tóxico construido integrando la molécula de

ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en un cromosoma de un organismo Clostridium perfringens no atenuado.

8. El organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 7, en el que la molécula de ácido nucleico está localizada en una posición en el cromosoma que es homóloga a la locación de una molécula de ácido nucleico que codifica una toxina alfa natural presente en el Clostridium perfringens no atenuado.

9. El organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 7 o de la reivindicación 8 que es un Clostridium perfringens de tipo A.

10. El organismo Clostridium perfringens atenuado de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9 en el que el Clostridium perfringens no atenuado a partir del cual se construyó el anterior fue aislado de un animal hospedador que es bien un mamífero o un ave.

11. El organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 10, en el que dicho mamífero se selecciona entre el grupo que consiste en un bovino, ovino, y porcino.

12. El organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 10 en el que dicha ave es un pollo, un pavo, un ganso, un pato, un cisne, una paloma, un pichón, un urogallo, o una perdiz.

13. El organismo Clostridium perfringens atenuado de una cualquiera de las reivindicaciones 7-12 que comprende al menos un gen que codifica un polipéptido no de Clostridium perfringens.

14. El organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 13 en el que dicho polipéptido no de Clostridium perfringens es un polipéptido no bacteriano.

15. El organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 14 en el que el polipéptido no bacteriano es un polipéptido de ave o de mamífero.

16. El organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 15 en el que el polipéptido no bacteriano es 55 un polipéptido de ave.

17. El organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 15 en el que el polipéptido no bacteriano es una citoquina.

18. El organismo Clostridium perfringens atenuado de la reivindicación 17 en el que la citoquina es IL-18 de pollo.

19. Un Clostridium perfringens atenuado tal como se define en las anteriores reivindicaciones 7-18 para uso como una vacuna en un procedimiento para inducir inmunidad a enfermedades producidas por infecciones con Clostridium perfringens en un animal, en el que dicho Clostridium perfringens atenuado se administra en una dosis

inmunológicamente eficaz.

20. El Clostridium perfringens atenuado para uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que la vacuna es para administración mediante las rutas oral, intramuscular, intravenosa, intradérmica, subcutánea, o intranasal.

21. El Clostridium perfringens atenuado para uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que la vacuna se reparte 5 en el alimento del animal.

22. El Clostridium perfringens atenuado para uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que la vacuna es para la administración como una pulverización sobre los animales para proporcionar la administración oral.

23. Un organismo Clostridium perfringens que es CPERF/ΔαToxi.

36. 054 que tiene el Nº de Depósito PTA7364 de la ATCC.

24. Un organismo clostridium perfringens que es CPERF/ΔαToxi.

36. 053 que tiene el Nº de depósito PTA7365 de la ATCC. 15

25. Una vacuna que comprende el organismo Clostridium perfringens atenuado de una cualquiera de las reivindicaciones 7-18, 23, o 24.

26. La vacuna de la reivindicación 25 que comprende además uno o más de los siguientes: un tampón 20 farmacológicamente aceptable, un excipiente, o un adyuvante.

27. Un pienso animal que comprende la vacuna de la reivindicación 25 o 26.