Obtención de imágenes y evaluación de embriones, ovocitos y células madre.

Un método para evaluar una buena o deficiente competencia para el desarrollo de un embrión humano,

que comprende

1) medir parámetros celulares del embrión humano in vitro, en donde dichos parámetros celulares incluyen:

(a) la duración de la primera citocinesis;

(b) el intervalo de tiempo entre la citocinesis 1 y la citocinesis 2; o

(c) el intervalo de tiempo entre la citocinesis 2 y la citocinesis 3, y

2) determinar que el embrión humano tiene una buena competencia para el desarrollo cuando,

(a') la duración de la primera citocinesis es de 0 a 30 minutos;

(b') el intervalo de tiempo entre la resolución de la citocinesis 1 y el comienzo de la citocinesis 2 es de 8-15 horas; o

(c') el intervalo de tiempo entre el comienzo de la citocinesis 2 y el comienzo de la citocinesis 3 es de 0-5 horas. en donde dichos parámetros celulares se miden por microscopía de lapso de tiempo.

Obtención de imágenes y evaluación de embriones, ovocitos y células madre

Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. No. 61/332, 651, presentada el 7 de Mayo de 2010 y la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. No. 61/236, 085, presentada el 22 de Agosto de 2009, las cuales están incorporadas por referencia en su totalidad a la presente solicitud.

Campo de la invención Esta invención se refiere al campo de los ensayos biológicos y clínicos, y particularmente a las técnicas de imagen y la evaluación de cigotos/embriones, ovocitos y células madre tanto de humanos como de animales.

Antecedentes de la invención La infertilidad es un problema de salud común que afecta a un 10-15% de las parejas en edad reproductiva. En los Estados Unidos solamente en el año 2006, se llevaron a cabo aproximadamente 140.000 ciclos de fecundación in vitro (FIV) (cdc.gov/arte) . Esto tuvo como resultado el cultivo de más de un millón de embriones anualmente con un potencial variable y, con frecuencia mal definido, para la implantación y desarrollo a término. La tasa de nacidos vivos por ciclo, después de la FIV fue sólo del 29%, mientras que un promedio del 30% de los nacidos vivos resultaron de gestaciones múltiples (cdc.gov/arte) . Se han documentado bien las consecuencias adversas de las gestaciones múltiples tanto para la madre como para los fetos, tales como aborto involuntario, parto prematuro, y baja tasa de natalidad. Las posibles causas del fracaso de la FIV son diversas; sin embargo, desde la introducción de la FIV en 1978, uno de los retos más importantes ha sido la identificación de los embriones que son los más adecuados para la transferencia y los que sea más probable que den como resultado un embarazo a término.

La comprensión en la técnica del desarrollo embrionario básico es limitada ya que los estudios sobre la biología del embrión humano continúan siendo un reto y, frecuentemente se excluyen de la financiación para investigación. En consecuencia, la mayor parte del conocimiento actual de desarrollo embrionario se deriva de los estudios de organismos modelo. Sin embargo, mientras que los embriones de diferentes especies pasan por etapas de desarrollo similares, el tiempo varía según la especie. Estas diferencias, y muchas otras, hacen inapropiado extrapolar directamente de una especie a otra (Taft, R.E. (2008) Theriogenology 69 (1) :10-16) . Las vías generales de desarrollo humano, así como los determinantes moleculares fundamentales subyacentes, son únicos para el desarrollo embrionario humano. Por ejemplo, en los ratones, la transcripción embrionaria se activa aproximadamente 12 horas después de la fecundación, simultáneamente con la primera división de escisión, mientras que en los humanos la activación de genes embrionarios (EGA) se produce en el día 3, alrededor del estadio de 8 células (Bell, E. C., et al., (2008) Mol. Hum. Reprod. 14:691-701; Braude, P., et al., (1988) Nature 332:459-461; Hamatani, T. et al., (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101:10326-10331; Dobson, T. et al., (2004) Human Molecular Genetics 13 (14) :1461-1470) . Además, los genes que se modulan en el desarrollo humano temprano son únicos (Dobson, T. et al., (2004) Human Molecular Genetics 13 (14) :1461-1470) . Por otra parte, en otras especies como el ratón, más del 85% de los embriones cultivados in vitro alcanzan el estadio de blastocisto, uno de los primeros puntos de referencias importantes en el desarrollo de los mamíferos, mientras que los cultivos de embriones humanos tienen una tasa promedio de formación de blastocistos de aproximadamente 30-50%, con una alta incidencia de mosaicismos y fenotipos aberrantes, tales como la fragmentación y detención del desarrollo (Rienzi, L. et al., (2005) Reprod. Biomed. Online 10:669-681; Alikani, M., et al., (2005) Mol. Hum. Reprod. 11:335344; Keltz, MD, et al., (2006) Fertil. Steril. 86:321-324; French, D. B., et al., (2009) Fertil. Steril.) . A pesar de estas diferencias, la mayoría de los estudios de desarrollo embrionario preimplantacional se derivan de organismos modelo y son difíciles de relacionarse con el desarrollo de embriones humanos (Zernicka-Goetz, M. (2002) Development 129:815-829; Wang, Q., et al. (2004) Dev Cell. 6:133-144; Bell, C. E., et al. (2008) Mol. Hum. Reprod. 14:691-701; Zernicka-Goetz, M. (2006) Curr. Opin. Genet. Dev. 16:406-412; Mtango, N. R., et al. (2008) Int. Rev. Cell. Mol. Biol. 268:223-290) .

Tradicionalmente, en las clínicas de FIV, la viabilidad del embrión humano se ha evaluado mediante simples observaciones morfológicas, tales como la presencia de blastómeros mononucleados de tamaño uniforme, y el grado de fragmentación celular (Rijinders PM, Jansen CAM. (1998) Hum Reprod 13:2869-73.; Milki AA, et al., (2002) Fertil Steril 77:1191-5) . Más recientemente, métodos adicionales tales como el cultivo extendido de embriones (hasta el estadio de blastocisto en el día 5) y el análisis del estado cromosómico mediante el diagnóstico genético preimplantacional (DGP) también se han usado para evaluar la calidad de los embriones (Milki A, et al. (2000) Fertil Steril 73:126-9; Fragouli E, (2009) Fertil Steril 21 de junio [PubE lista para impresión]. El-Toukhy T, et al., (2009) Hum Reprod 6:20; Vanneste E, et al., (2009) Nat Med 15:577-83) . Sin embargo, también existen riesgos potenciales de estos métodos en el hecho de que prolongan el período de cultivo y alteran la integridad del embrión (Manipalviratn S, et al., (2009) Fertil Steril 91:305-15; Mastenbroek S, et al., (2007) N Engl J. Med. 357:9-17) .

Recientemente se ha demostrado que las técnicas de imagen de lapso de tiempo pueden ser una herramienta útil para observar el desarrollo embrionario temprano. Algunos métodos han utilizado las técnicas de imagen de lapso de tiempo para monitorizar el desarrollo embrionario humano después de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) (Nagy et al., (1994) Human Reproduction. 9 (9) :1743-1748; Payne et al., (1997) Human Reproduction 12:532-541) . Se analizó la extrusión del cuerpo polar y la formación pronuclear y se correlacionaron con buena morfología en el día 3. Sin embargo, ningún parámetro se correlacionó con la formación de blastocistos o con los resultados del embarazo. Otros métodos han observado la aparición de la primera escisión como un indicador para predecir la viabilidad de los embriones humanos (Fenwick, et al., (2002) Human Reproduction, 17:407-412; Lundin, et al., (2001) Human Reproduction 16:2652-2657) . Sin embargo, estos métodos no reconocen la importancia de la duración de la citocinesis o de los intervalos de tiempo entre las divisiones tempranas.

Otros métodos han utilizado las técnicas de imagen de lapso de tiempo para medir la cadencia y la extensión de las divisiones celulares durante el desarrollo embrionario temprano (WO/2007/144001) . Sin embargo, estos métodos solamente divulgan un método básico y general para la obtención de imágenes en lapso de tiempo de embriones de bovinos, que son sustancialmente diferentes de los embriones humanos en términos de potencial de desarrollo, comportamiento morfológico, programas moleculares y epigenéticos, y cadencia y correspondencia de los parámetros circundantes. Por ejemplo, los embriones de bovinos tardan mucho más tiempo en implantarse en comparación con los embriones humanos (30 días y 9 días, respectivamente) . (Taft, (2008) Theriogenology 69 (1) :10-16) . Más aún, no se divulgan parámetros específicos de obtención de imágenes o de intervalos de tiempo que pudieran ser predictivos de la viabilidad del embrión humano.

Más recientemente, las técnicas de imagen de lapso de tiempo se han utilizado para observar el desarrollo embrionario humano durante las primeras 24 horas después de la fecundación (Lemmen et al., (2008) Reproductive BioMedicine Online 17 (3) :385-391) . Se encontró que la sincronía de los núcleos después de la primera división se correlacionaba con los resultados del embarazo. Sin embargo, este trabajo concluyó que la primera división temprana no era un parámetro predictivo importante, lo cual contradice estudios previos (Fenwick, et al. (2002) Human Reproduction 17:407-412; Lundin, et al. (2001) Human Reproduction 16:2652. -2657) .

Finalmente, ningún estudio ha validado los parámetros de la obtención de imágenes a través de la correlación con los programas moleculares o la composición cromosómica de los embriones. De esta manera, los métodos de evaluación de los embriones humanos están deficientes en varios aspectos y se pueden mejorar mediante los presentes métodos, los cuales implican nuevas aplicaciones de la microscopía de lapso de tiempo, análisis... [Seguir leyendo]

1. Un método para evaluar una buena o deficiente competencia para el desarrollo de un embrión humano, que comprende 1) medir parámetros celulares del embrión humano in vitro, en donde dichos parámetros celulares incluyen:

(a) la duración de la primera citocinesis;

(b) el intervalo de tiempo entre la citocinesis 1 y la citocinesis 2; o

(c) el intervalo de tiempo entre la citocinesis 2 y la citocinesis 3, y

2) determinar que el embrión humano tiene una buena competencia para el desarrollo cuando,

(a') la duración de la primera citocinesis es de 0 a 30 minutos; (b') el intervalo de tiempo entre la resolución de la citocinesis 1 y el comienzo de la citocinesis 2 es de 815 horas; o (c') el intervalo de tiempo entre el comienzo de la citocinesis 2 y el comienzo de la citocinesis 3 es de 0-5 horas. en donde dichos parámetros celulares se miden por microscopía de lapso de tiempo.

2. El método según la reivindicación 1, en el que los parámetros celulares incluyen:

(a) la duración de la primera citocinesis;

(b) el intervalo de tiempo entre la citocinesis 1 y la citocinesis 2; y

(c) el intervalo de tiempo entre la citocinesis 2 y la citocinesis 3.

3. El método según la reivindicación 1, en el que dichos parámetros celulares comprenden además la duración del ciclo celular 1.

4. El método según la reivindicación 3, en el que una buena competencia para el desarrollo de dicho embrión humano está indicada cuando la duración del ciclo celular 1 es de 20 a 27 horas.

5. El método según la reivindicación 1, en el que una competencia deficiente para el desarrollo de dicho embrión humano está indicada por que:

(a) la duración de la primera citocinesis es más larga que 30 minutos;

(b) el intervalo de tiempo entre la resolución de la citocinesis 1 y el comienzo de la citocinesis es menor que 8 horas o más largo que 15 horas; y/o

(c) el intervalo de tiempo entre el comienzo de la citocinesis 2 y el comienzo de la citocinesis 3 es mayor que 5 horas.

6. El método según la reivindicación 5, en el que dichos parámetros celulares además comprenden la duración del ciclo celular 1.

7. El método según la reivindicación 6, en el que una competencia deficiente para el desarrollo de dicho embrión humano está indicada cuando la duración del ciclo celular 1 es más larga que 27 horas.

8. El método según la reivindicación 1, en el que dichos embriones se producen mediante fecundación de ovocitos in vitro.

9. El método según la reivindicación 8, en el que dichos ovocitos se maduran in vitro.

10. El método según la reivindicación 9, en el que dichos ovocitos madurados in vitro son complementados con factores de crecimiento.

11. El método según la reivindicación 1, en el que los embriones no han sido congelados antes de medir los parámetros.

12. El método según la reivindicación 1, en el que los embriones han sido congelados antes de medir los parámetros.

13. El método según la reivindicación 1, en el que el embrión humano tiene una buena competencia para el desarrollo cuando la duración de la primera citocinesis es de 0 a 30 minutos.

14. El método según la reivindicación 1, en el que el embrión humano tiene una buena competencia para el desarrollo cuando el intervalo de tiempo entre la resolución de la citocinesis 1 y el comienzo de la citocinesis 2 es de 8-15 horas.

15. El método según la reivindicación 1, en el que el embrión humano tiene una buena competencia para el desarrollo cuando el intervalo de tiempo entre el comienzo de la citocinesis 2 y el comienzo de la citocinesis 3 es de 0-5 horas.

16. El método según la reivindicación 1, en el que el embrión humano tiene una buena competencia para el

desarrollo cuando el intervalo de tiempo entre la resolución de la citocinesis 1 y el comienzo de la citocinesis 2 es de 8-15 horas y el intervalo de tiempo entre el comienzo de la citocinesis 2 y el comienzo de la citocinesis 3 es de 0-5 horas

Duración de 1ra. citocinesis

Embriones detenidos de 2 células Embriones normales de 2 células

Embriones detenidos de 4 células Embriones normales de 4 células

Expresión relativa

Figura 19

Tabla 1

Categoría # de genes

Apoptosis 5

Citocinesis 10

Diferenciación 9

Activación de genes embrionarios 10

Epigenética 5

Célula germinal 9

Constitutivo 10

Ligando / receptor 11

Efecto materno 8

miARN 5

Pluripotencia 7

Procesamiento de ARN 7

Específico de sexo 2

TE / ICM 14

Factor de transcripción 11

Figura 20

Figura 23