Nitrilo hidratasa procedente de rhodococcus.

Racimo aislado de polinucleótidos procedente de Rhodococcus opacus,

que contiene cuatro secuencias de nucleótidos, que codifican cuatro polipéptidos con unas secuencias de aminoácidos, que son idénticas en cada caso en por lo menos un 90 % con las secuencias de aminoácidos contenidas en las secuencias SEQ ID NO:2 hasta SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6, poseyendo los polipéptidos las actividades de una nitrilo hidratasa, que se compone de las subunidades α y ß, de la proteína auxiliadora P15K y de un transportador de cobalto

Nitrilo hidratasa procedente de Rhodococcus El invento se refiere a un racimo de polinucleótidos procedente de Rhodococcus, que codifica unos polipéptidos con la actividad de una nitrilo hidratasa, a una proteína auxiliadora P15K, que activa a esta enzima, y a unas secuencias de nucleótidos, que codifican un transportador de cobalto, a unos microorganismos transformados con ellas, en los que las secuencias de nucleótidos que codifican estas proteínas se presentan de manera reforzada, y a la utilización de los microorganismos transformados para la preparación de amidas a partir de nitrilos.

Las nitrilo hidratasas ya se describieron en gran número en la bibliografía (Synthetic applications of nitrileconverting enzymes [Aplicaciones sintéticas de enzimas convertidoras de nitrilos]; Martinkova, Ludmila; Mylerova, Veronika; Current Organic Chemistr y (2003) , 7 (13) , 1279-1295) . Ya desde 1983 se emplean nitrilo hidratasas para la preparación de acrilamida a la escala de varios miles de toneladas por año. Este procedimiento biocatalítico se ha acreditado como competitivo en comparación con los procedimientos químicos (Enzymic synthesis of acr y lamide: a success stor y not yet over [Síntesis enzimática de acrilamida: una historia exitosa que no ha acabado todavía]; Kobayashi, Michihiko; Nagasawa, Toru; Yamada, Trends in Biotechnology (1992) , 10 (11) , 402-8) .

Junto a las nitrilo hidratasas, que se pueden emplear para la conversión química de acrilonitrilo, se describieron p.ej. también aquellas que son especialmente adecuadas para la conversión química de metacrilonitrilo (A nitrile hydratase of Pseudonocardia thermophila and the genes encoding and manufacture of the enzyme for conversion of nitriles to amides [Una nitrilo hidratasa de Pseudonocardia thermophila y los genes que la codifican, y la manipulación de la enzima para la conversión de nitrilos en amidas] (documento de patente europea EP 790310) , de 3-cianopiridina (Process for producing amides with Rhodococcus nitrile hydratase [Un procedimiento para producir amidas con la nitrilo hidratasa de Rhodococcus], (documento de solicitud de patente internacional WO 2002055670)

o de 2-hidroxinitrilos tales como el 2-hidroxi-4-metiltio-butironitrilo (A nitrile hydratase of Rhodococcus and its use in the manufacture of amides [Una nitrilo hidratasa de Rhodococcus y su uso en la preparación de amidas] (documento WO 2002070717) and Enzymic conversion of α-hydroxynitriles to the corresponding α-hydroxyamides, acids o acid salts [Y la conversión enzimática de α-hidroxinitrilos para dar las correspondientes α-hidroxiamidas, ácidos o sales de ácidos] (documento WO 9832872) . En contraposición a esto, hasta ahora no se conoce en absoluto ninguna nitrilo hidratasa, con cuya ayuda se puedan convertir químicamente de una manera efectiva los 2-aminonitrilos. La nitrilo hidratasa procedente de Rhodococcus sp. Cr4 convierte químicamente p.ej. a los 2-hidroxinitrilos con una alta actividad, pero no en absoluto a un sencillo 2-aminonitrilo tal como el aminoacetonitrilo (documento WO 2002070717) .

La conversión enzimática de aminonitrilos en las correspondientes amidas abre una atractiva ruta de síntesis para dar aminoácidos, puesto que las 2-aminoamidas pueden ser saponificadas de un modo sencillo (documento WO 2001060789) . Este proceso transcurre en condiciones moderadas, con una selectividad muy alta y sin la formación de productos secundarios tales como unas sales, como las que resultan en el caso de la hidrólisis química.

Alternativamente, ciertas amidas se pueden hacer reaccionar también con hidróxidos de metales alcalinos o alcalinotérreos para dar las correspondientes sales de los ácidos. Se prefiere especialmente este modo de proceder en el caso del empleo del hidróxido de calcio para la conversión química de la 4-metiltio-α-hidroxibutiramida (amida de MHA) ; puesto que la sal de calcio del MHA se puede emplear directamente como una forma de producto alternativa a la metionina o al MHA como aditivo para piensos.

Para la preparación de un producto comercial, tal como p.ej. la DL-metionina, no es suficiente, sin embargo, poner a disposición un catalizador con una alta actividad. Para el aumento de la actividad se debe de establecer un sistema de expresión para los genes que deben de ser reforzados. Para esto se aconseja la expresión heteróloga p.ej. sobre todo en el seno de Escherichia coli, Bacillus, Pseudomonas, Pichia, Sacharomyces o Aspergillus, puesto que estos microorganismos poseen un rápido crecimiento, alcanzan unas muy altas densidades celulares y están disponibles unas herramientas de biología molecular que permiten un muy alto nivel de expresión (Lee SY (1996) High celldensity culture of Escherichia coli [Cultivo con alta densidad celular de Escherichia coli] TIBTECH 14:98-105; Riesenberg D, Guthke R (1999) High-cell-density cultivation of microorganisms [Cultivación con alta densidad celular de microorganismos]. Appl Microbiol Biotechnol 51:422-430) .

Es conocido el hecho de que para la expresión heteróloga de unas nitrilo hidratasas deben de ser expresados concomitantemente por lo menos 3 genes. Junto a los dos genes estructurales, además de esto, debe de ser reforzada una correspondiente proteína auxiliadora tanto para las enzimas que dependen del hierro como también para las enzimas que dependen del cobalto (Nojiri M. y colaboradores, (1999) Functional expression of Nitrile hydratases in Escherichia coli: Requirement of a nitrile hydratase activator and a post-translational modification of a ligand cysteine [Expresión funcional de nitrilo hidratasas en Escherichia coli: Necesidad de un activador de la nitrilo hidratasa y modificación después de la traducción de un ligando de cisteína]. J. Biochem 125: 696-704, y Overproduction of stereoselective nitrile hydratase from Pseudomonas putida 5B in Escherichia coli: activity requires a novel downstream protein [Sobreproduccción de una nitrilo hidratasa estereoselectiva procedente de Pseudomonas putida 5B en E. coli: la actividad requiere una nueva proteína corriente abajo], Wu, S.; Fallon, R. D.; Payne, M. S. Applied Microbiology and Biotechnology (1997) , 48 (6) , 704-708) .

Adicionalmente a estos 3 genes, en Rhodococcus rhodochrous J1, en un racimo de genes, junto a los genes estructurales y al gen de la proteína auxiliadora, se encontró otro gen que codifica un transportador de cobalto (A novel transporter involved in cobalt uptake [Un nuevo transportador que participa en la absorción de cobalto], Komeda, Hidenobu y colaboradores, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America [Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América] (1997) , 94 (1) , 36-41) . Tanto la sobreexpresión en Rhodococcus como también la expresión concomitante en E. coli dan lugar a una absorción aumentada de iones de Co2+ a partir del medio de cultivo. Además de esto, se pudo mostrar que en el caso de la expresión concomitante del transportador de cobalto en común con las otras 3 proteínas se puede conseguir la misma actividad de nitrilo hidratasa en el caso de una concentración más baja de Co en el medio, en comparación con la expresión a solas de los genes estructurales y de la proteína auxiliadora. No obstante, este efecto aparece en Rhodococcus, de acuerdo con Komeda y colaboradores, solamente en el caso de unas concentraciones situadas por debajo de 42 µM.

A partir del documento EP 0 362 829 se conoce la fermentación de Rhodococcus rhodochrous en presencia de sales de cobalto.

Es una misión del invento hacer accesibles unas nitrilo hidratasas con una alta actividad, que en particular conviertan químicamente a los α-aminonitrilos en amidas.

El invento comprende los siguientes objetos:

1. Un racimo aislado de polinucleótidos procedentes de Rhodococcus opacus, que contiene cuatro secuencias de nucleótidos, que codifican cuatro polipéptidos con unas secuencias de aminoácidos, que son idénticas en cada caso en por lo menos un 90 % con las secuencias de aminoácidos contenidas en las secuencias SEQ ID NO:2 hasta SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6, poseyendo los polipéptidos las actividades de una nitrilo hidratasa, que se compone de unas subunidades α y β, de la proteína auxiliadora P15K y de un transportador de cobalto.

2. Unos polinucleótidos de acuerdo con 1., escogidos entre el conjunto que se compone de

a) un polinucleótido, que se compone de las posiciones 1 hasta 708 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1 o de la secuencia de nucleótidos complementaria con ésta,

b) un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos, que corresponde a la secuencia procedente de a) dentro del marco de la degeneración del código... [Seguir leyendo]

1. Racimo aislado de polinucleótidos procedente de Rhodococcus opacus, que contiene cuatro secuencias de nucleótidos, que codifican cuatro polipéptidos con unas secuencias de aminoácidos, que son idénticas en cada caso en por lo menos un 90 % con las secuencias de aminoácidos contenidas en las secuencias SEQ ID NO:2 hasta SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6, poseyendo los polipéptidos las actividades de una nitrilo hidratasa, que se compone de las subunidades α y β, de la proteína auxiliadora P15K y de un transportador de cobalto.

2. Polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1, escogidos entre el conjunto que se compone de:

a) un polinucleótido, que se compone de las posiciones 1 hasta 708 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1 o de la secuencia de nucleótidos complementaria con ésta,

b) un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos, que corresponde a la secuencia procedente de a) dentro del marco de la degeneración del código genético,

c) un polinucleótido, que se hibrida en condiciones rigurosas con las secuencias complementarias a) o b) , abarcando las condiciones rigurosas el lavado en 0, 1 x SSC a una temperatura d.

5. 68°C y

d) un polinucleótido, con una secuencia de nucleótidos procedente de a) , b) o c) , que contiene unas mutaciones con sentido neutras en su función,

codificando los polinucleótidos la subunidad β de la nitrilo hidratasa.

3. Polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1, escogidos entre el conjunto que se compone de:

a) un polinucleótido, que se compone de las posiciones 710 hasta 1.327 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1 o de la secuencia de nucleótidos complementaria con ésta,

b) un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos, que corresponde a la secuencia procedente de a) dentro del marco de la degeneración del código genético,

c) un polinucleótido, que se hibrida en condiciones rigurosas con las secuencias complementarias procedentes de a) o b) , abarcando las condiciones rigurosas el lavado en 0, 1 x SSC a una temperatura d.

5. 68°C y

d) un polinucleótido, con una secuencia de nucleótidos procedente de a) , b) o c) , que contiene unas mutaciones con sentido neutras en su función,

codificando los polinucleótidos la subunidad α de la nitrilo hidratasa, y codificando los polinucleótidos la proteína auxiliadora P15K.

4. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que contiene las secuencias de aminoácidos, que son idénticas por lo menos en un 90 % con las SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3, teniendo el polipéptido la actividad de una nitrilo hidratasa.

5. Una sonda o un cebador, que contiene por lo menos 20 nucleótidos consecutivos dentro de las posiciones 1 hasta

1.327 de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1 o de su forma complementaria.

6. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 2, que se hibrida en condiciones rigurosas con el complemento con las posiciones 1 hasta 708 de la SEQ ID NO:1, abarcando las condiciones rigurosas el lavado en 0, 1 x SSC a una temperatura de 50 a 68°C.

7. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 3, que se hibrida en condiciones rigurosas con el complemento con las posiciones 710 hasta 1.327 de la SEQ ID NO:1, abarcando las condiciones rigurosas el lavado en 0, 1 x SSC a una temperatura de 50 a 68°C.

8. Unos vectores que contienen un (os) polinucleótido (s) escogidos entre los de las reivindicaciones 1 hasta 3 y 6 hasta 7.

9. El vector pUD15, que se compone de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:24.

10. El vector pUD16, que se compone de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:25.

11. Una célula anfitriona, transformada o transfectada mediante la introducción de un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1.

12. Una célula anfitriona, transformada mediante la introducción de un vector de acuerdo con las reivindicaciones 8 hasta 10.

13. Una célula anfitriona transformada de acuerdo con las reivindicaciones 11 o 12, siendo la célula anfitriona una 5 bacteria de la familia de las Enterobacteriaceae, en particular Escherichia coli.

14. Procedimiento para la preparación de amidas a partir de nitrilos con unas nitrilo hidratasas procedentes de Rhodococcus o de unos microorganismos que contienen esta enzima, en el que a) un microorganismo transformado, que contiene unos genes sobreexpresados con las secuencias de nucleótidos escogidas entre las de las reivindicaciones 1 hasta 3 y 6, 7, se fermenta en presencia de 0, 15 a 4 mM de Co2+, en unas condiciones, que dan lugar a la formación de la nitrilo hidratasa, b) esta enzima se deja enriquecer en el microorganismo, y c) esta enzima se aísla a partir de las células, o d) se cosechan los microorganismos y se obtienen las células en reposo, que contienen la enzima, y e) la enzima o los microorganismos que la contienen se hacen reaccionar con los compuestos de las y 20 R''-CN (II)

en las que significan:

X: OH, H, alquilo con 1 a 4 átomos de C, en particular NH2;

R: H, un radical alquilo saturado con 1 a 12 átomos de C, ramificado o sin ramificar, eventualmente sustituido con NH2, radicales alquenilo con 1 a 12 átomos de C, ramificados o sin ramificar, o grupos cicloalquilo con 3 a 6 átomos de C,

radicales alquileno sustituidos con grupos alquiltio, correspondiendo el alquilo aquí a un radical de C1 a C3 y el alquileno a un radical divalente de C3 a C8, R': H, alquilo con 1 a 3 átomos de C, R'': un anillo insaturado de uno o dos núcleos, con 6 a 12 átomos de C, eventualmente sustituido con uno o dos grupos alquilo de C1 - C3, Cl, Br o F, un radical alquil-nitrilo monovalente con 1 a 6 átomos de C,

para dar las correspondientes amidas,

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque se emplean unas células anfitrionas de acuerdo con las reivindicaciones 11 hasta 13.

16. Nitrilo hidratasa producida recombinantemente de acuerdo con la reivindicación 14 con el origen de Rhodococcus opacus, que convierte químicamente a los α-aminonitrilos con una actividad específica de >50 U/mg de biomasa seca.

Figura 1 Figura 2 Figura 3