Métodos y composiciones basados en micro-ARN para el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades relacionadas con el colon.

Un método para diagnosticar si el sujeto tiene un adenocarcinoma de colon con mal pronóstico de supervivencia,

que comprende:

medir el nivel de al menos un producto génico de miR-181b en una muestra de ensayo del sujeto en donde dichosujeto tiene adenocarcinoma de colon,

en el que un aumento en al menos el nivel del producto génico de miR-181b en la muestra de ensayo, conrespecto al nivel de un producto génico de miR-181b correspondiente en una muestra de control, es indicativo deque el sujeto tiene adenocarcinoma de colon con mal pronóstico de supervivencia.

Métodos y composiciones basados en micro-ARN para el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades relacionadas con el colon 5

Antecedentes de la invención

El adenocarcinoma de colon es una causa importante de mortalidad por cáncer en todo el mundo1. El cáncer colorrectal es la tercera causa más común y la segunda principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos2. Los adenocarcinomas de colon esporádicos se inician como adenomas y evolucionan a través de una progresión de cambios moleculares, celulares e histológicos3. Aunque las tasas de mortalidad en 5 años han disminuido ligeramente durante las últimas 3 décadas4, aún existe una necesidad de identificar nuevos biomarcadores de diagnóstico y dianas terapéuticas para esta enfermedad. Actualmente, la quimioterapia tiene un valor terapéutico significativo pero la cirugía es la única forma curativa de tratamiento5.

Las dianas terapéuticas ideales se deberían asociar causalmente con la enfermedad y son susceptibles de diseño de intervenciones terapéuticas; mientras que los biomarcadores ideales deberían ser fáciles de medir y tienen fuertes asociaciones con los resultados clínicos. Los microARN podrían combinar ambos criterios6-8 .

Los microARN son moléculas de ARN no codificante, de 18-25 nucleótidos que regulan la traducción de muchos genes 9. Desde su descubrimiento10, 11, se ha encontrado que regulan diversos procesos celulares que incluyen la apoptosis12-14, diferenciación10, 11, 15 y proliferación celular 16. Los microARN también pueden desempeñar un papel causal en la carcinogénesis6, 17. Los niveles de expresión de microARN están alterados en la mayoría de los tipos de tumores18, 19, que incluyen los tumores de colon19-22. Los microARN miR-15 y miR-16a están suprimidos o regulados negativamente en la mayoría de las leucemias linfocíticas crónicas23. La manipulación experimental de microARN específicos modula el desarrollo tumoral en sistemas de modelos de ratón16, 24-26. También se ha demostrado el potencial pronóstico de micro-ARN para la leucemia linfocítica crónica7, cáncer de pulmón8 y neuroblastomas27.

La expresión anómala de los microARN puede ser causal a la carcinogénesis, y la inhibición de microARN específicos puede tener implicaciones terapéuticas. Se pueden diseñar oligonucleótidos antisentido modificados para inhibir específicamente la función de microARN28. Los antagómiros son un tipo de oligonucleótidos antisentido que se ha probado que son eficaces en la inhibición de la función de microARN in vivo en ratones29. La facilidad para diseñar inhibidores específicos de la función de microARN los hace candidatos para dianas terapéuticas.

Sumario de la invención La invención se refiere a un método para diagnosticar si un sujeto tiene un adenocarcinoma de colon con un mal pronóstico de supervivencia, que comprende:

medir el nivel de menos un producto génico de miR-181 b en una muestra de ensayo del sujeto en el que dicho sujeto tiene un adenocarcinoma de colon, en el que un aumento en al menos el nivel del producto génico de miR-181b en la muestra de ensayo, con respecto al nivel de un producto génico de miR-181 b correspondiente en una muestra de control, es indicativo de que el sujeto tiene un adenocarcinoma de colon con mal pronóstico de supervivencia.

La invención también se refiere a un método para someter a ensayo un adenocarcinoma de colon con mal pronóstico de supervivencia, que comprende:

(1) determinar un nivel de expresión de al menos un marcador en una muestra de un sujeto de ensayo que tiene adenocarcinoma de colon; y él al menos un marcador incluye al menos un producto génico de miR-181 b;

(2) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa (1) con un nivel de expresión de control del marcador en una muestra de un sujeto sano; y

(3) considerar que el sujeto tiene un adenocarcinoma de colon con mal pronóstico de supervivencia cuando el resultado de la comparación en la etapa (2) indica que:

el nivel de expresión del al menos un marcador en el sujeto de ensayo es mayor que en el control.

La invención también se refiere a un método para diagnosticar si un sujeto tiene adenocarcinoma de colon con mal pronóstico de supervivencia, que comprende:

(1) transcripción inversa del ARN a partir de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana en la que dicho sujeto tiene adenocarcinoma de colon;

(2) hibridar los oligodesoxinucleótidos diana a una micromatriz que comprende oligonucleótidos de sonda específica miARN-181b para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de ensayo; y

(3) comparar el perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación generado a partir de una muestra de control, en el que un aumento en la señal del miR-181b es indicativo de que el sujeto tiene adenocarcinoma de colon con mal pronóstico de supervivencia.

La muestra de que comprender una o más de tejido, sangre, plasma, suero, orina, y heces. Además, todas las etapas del método se pueden realizar in vitro.

En un aspecto en particular, la señal de al menos un miARN, con respecto a la señal generada a partir de la muestra de control, está regulada de forma positiva o negativa. Además, la micromatriz puede comprender oligonucleótidos sonda específicos de miARN para uno o más miARN seleccionados entre el grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos.

En otro amplio aspecto, en el presente documento se proporciona un método para inhibir la tumorogénesis en un sujeto que tiene, o que se sospecha que tiene, una enfermedad relacionada con el cáncer de colon en el que al

menos un producto génico de miR seleccionado entre el grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR181b, miR-203 y combinaciones de los mismos, está regulado negativamente o regulado positivamente en las células cancerosas del sujeto, con respecto a las células de control, que comprende:

(1) cuando el al menos un producto génico de miR está regulado negativamente en las células cancerosas,

administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un producto génico de miR aislado seleccionado entre el grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos, de modo que la tumorogénesis se inhibe en el sujeto; o (2) cuando el al menos un producto génico de miR está regulado positivamente en las células cancerosas,

administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresión de al menos un producto génico de miR seleccionado entre el grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR203 y combinaciones de los mismos, de modo que la tumorogénesis se inhibe en el sujeto.

En un aspecto en particular, al menos un producto génico de miR aislado en la etapa (1) y/o en la etapa (2) es miR

21 o una variante aislada o fragmento biológicamente activo o equivalente funcional de los mismos, o un anticuerpo que se une a los mismos.

En otro amplio aspecto, en el presente documento se proporciona un método para inhibir la tumorogénesis en un sujeto que tiene un cáncer de colon, que comprende:

(1) determinar la cantidad de al menos un producto génico de miR en células cancerosas del sujeto, con respecto a las células de control; y

(2) alterar la cantidad de producto génico de miR expresado en las células cancerosas mediante: 40

(i) administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un producto génico de miR aislado seleccionado entre el grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a, miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos, si la cantidad de producto génico de miR expresado en las células cancerosas es menor que la cantidad de producto génico de miR expresado en las células de control; o (ii) administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresión de al menos un producto génico de miR, si la cantidad de producto génico de miR expresado en las células cancerosas es mayor de la cantidad de producto génico de miR expresado en las células de control,

de modo que la tumorogénesis se inhibe en el sujeto.

En un aspecto en particular, el al menos un producto génico de miR aislado en la etapa (i) es miR-21 o una variante aislada o fragmento biológicamente activo del mismo. Además, en determinadas realizaciones, el al menos un producto génico de miR en la etapa (ii) está seleccionado entre el grupo que consiste en miR20a, miR-21, miR-106a,

miR-181b, miR-203 y combinaciones de los mismos, o una variante aislada o fragmento... [Seguir leyendo]

1. Un método para diagnosticar si el sujeto tiene un adenocarcinoma de colon con mal pronóstico de supervivencia, que comprende:

medir el nivel de al menos un producto génico de miR-181b en una muestra de ensayo del sujeto en donde dicho sujeto tiene adenocarcinoma de colon, en el que un aumento en al menos el nivel del producto génico de miR-181b en la muestra de ensayo, con respecto al nivel de un producto génico de miR-181b correspondiente en una muestra de control, es indicativo de que el sujeto tiene adenocarcinoma de colon con mal pronóstico de supervivencia.

2. Un método para someter a ensayo un adenocarcinoma de colon con mal pronóstico de supervivencia, que comprende:

(1) determinar un nivel de expresión de al menos un marcador en una muestra de un sujeto de ensayo que tiene adenocarcinoma de colon; incluyendo el al menos un marcador al menos un producto génico de miR-181b;

(2) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa (1) con un nivel de expresión de control del marcador en una muestra de un sujeto sano; y

(3) considerar que el sujeto tiene un adenocarcinoma de colon con mal pronóstico de supervivencia cuando el 20 resultado de la comparación en la etapa (2) indica que:

el nivel de expresión del al menos un marcador en el sujeto de ensayo es mayor que en el control.

3. El método de ensayo de la reivindicación 2, en el que la muestra comprende uno o más de tejido, sangre, plasma, 25 suelo, orina y heces.

4. El método de ensayo de la reivindicación 2, en el que todas las etapas del método se realizan in vitro.

5. Un método para diagnosticar si el sujeto tiene adenocarcinoma de colon con mal pronóstico de supervivencia, que 30 comprende:

(1) transcribir inversamente el ARN a partir de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana en donde dicho sujeto tiene adenocarcinoma de colon;

(2) hibridar los oligodesoxinucleótidos diana a una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda 35 específicos de miR-181b para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de ensayo; y

(3) comparar el perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación generado a partir de una muestra de control,

en el que un aumento en la señal del miR-181b es indicativo de que el sujeto tiene adenocarcinoma de colon con 40 mal pronóstico de supervivencia.

6. El método de la reivindicación 1, en el que un nivel de expresión de producto génico de miR-181b se evalúa mediante la detección de la presencia de un polinucleótido transcrito o parte del mismo, en el que el polinucleótido transcrito comprende una región de codificación de producto génico de miR-181b.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra es un fluido o tejido corporal asociado con el cáncer de colon.

8. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra comprende células obtenidas del paciente. 50

9. El método de la reivindicación 1, en el que el al menos un producto génico de miR-181b incluye variantes aisladas o fragmentos biológicamente activos de las mismas.

10. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente medir el nivel de al menos un producto génico 55 de miR adicional en la muestra de ensayo, en el que el miR está seleccionado entre el grupo que consiste en: miR21; let-7g; miR-16b; miR-106a; miR-103-2; miR-203; miR-29a; y miR-10a.

11. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente medir el nivel de al menos dos o más productos génicos de miR adicionales en la muestra de ensayo, en el que los miR están seleccionados entre el grupo que 60 consiste en: miR-21; let-7g; miR-16b; miR-106a; miR-103-2; miR-203; miR-29a; y miR-10a.

12. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente medir el nivel de al menos tres o más productos génicos de miR adicionales en la muestra de ensayo, en el que los miR están seleccionados entre el grupo que consiste en: miR-21; let-7g; miR-16b; miR-106a; miR-103-2; miR-203; miR-29a; y miR-10a.

13. El método de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente medir el nivel de al menos un producto génico de miR adicional en la muestra de ensayo, en el que el miR está seleccionado entre el grupo que consiste en: miR21; let-7g; miR-16b; miR-106a; miR-103-2; miR-203; miR-29a; y miR-10a.

14. El método de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente medir el nivel de al menos dos o más productos génicos de miR adicionales en la muestra de ensayo, en el que los miR están seleccionados entre el grupo que consiste en: miR-21; let-7g; miR-16b; miR-106a; miR-103-2; miR-203; miR-29a; y miR-10a.

15. El método de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente medir el nivel de al menos tres o más productos génicos de miR adicionales en la muestra de ensayo, en el que los miR están seleccionados entre el grupo que consiste en: miR-21; let-7g; miR-16b; miR-106a; miR-103-2; miR-203; miR-29a; y miR-10a.

16. El método de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente medir el nivel de al menos un producto génico de miR adicional en la muestra de ensayo, en el que el miR está seleccionado entre el grupo que consiste en: miR15 21; let-7g; miR-16b; miR-106a; miR-103-2; miR-203; miR-29a; y miR-10a.

17. El método de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente medir el nivel de al menos dos o más productos génicos de miR adicionales en la muestra de ensayo, en el que los miR están seleccionados entre el grupo que consiste en: miR-21; let-7g; miR-16b; miR-106a; miR-103-2; miR-203; miR-29a; y miR-10a.

18. El método de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente medir el nivel de al menos tres o más productos génicos de miR adicionales en la muestra de ensayo, en el que los miR están seleccionados entre el grupo que consiste en: miR-21; let-7g; miR-16b; miR-106a; miR-103-2; miR-203; miR-29a; y miR-10a.

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