Métodos para purificar anticuerpos de la región Fc.

Un método para purificar un anticuerpo con una región Fc a partir de un líquido fuente que consta delanticuerpo y una o más impurezas,

con las siguientes etapas:

absorber el anticuerpo hacia un agente aglutinador Fc que consta de una o más Proteínas A yProteínas G;

lavado del agente aglutinador Fc con una solución amortiguadora con CaCI2 en una concentraciónde 0,5 M a 3 M para eliminar una o más impurezas; y

recuperar el anticuerpo del agente aglutinador Fc mediante la elución del anticuerpo en un búferde elución con un pH de 2 a 4.

Métodos para purificar anticuerpos de la región Fc.

SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reclama prioridad ante la solicitud de patente provisional “MÉTODOS DE PURIFICAR LA REGIÓN Fc CON CONTENIDO DE PROTEÍNAS”, presentada el 17 de junio de 2005, con número de serie 60/691821.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los anticuerpos son poderosos componentes del sistema inmune de muchos animales y especialmente de los humanos. Avances recientes en tecnología recombinante han posibilitado la producción de anticuerpos contra virtualmente cualquier objetivo, por ejemplo, células cancerígenas, bacterias y virus. Por lo general, un anticuerpo se produce utilizando una línea celular que ha sido diseñada para expresar el anticuerpo a altos niveles. La línea celular diseñada crece en un cultivo que consta de una mezcla compleja de azúcares, aminoácidos y factores de crecimiento, además de diversas proteínas, incluyendo, por ejemplo, proteínas séricas. No obstante, la separación de anticuerpos completos de derivados celulares y componentes de cultivo hasta una pureza suficiente para su uso en investigación o como terapéutica supone un formidable reto. La purificación de las moléculas de anticuerpo resulta de vital importancia si los anticuerpos se van a utilizar como medicamento para su administración a humanos.

Los esquemas (o trenes) tradicionales de purificación de anticuerpos suelen constar de una etapa de cromatografía que explota una capacidad de la molécula de anticuerpo de ligar o ser retenido por la fase sólida (o fase sólida funcional) de una columna de cromatografía comparada con la vinculación o retención de varias impurezas. Algunos esquemas se han propuesto o se han llevado a cabo para purificar anticuerpos que primero enlazan regiones CH2/CH3 que contienen proteínas con la Proteína A inmovilizada en una fase sólida, seguido de la eliminación de impurezas enlazadas con la fase sólida al lavar la fase sólida con un disolvente electrolito hidrofóbico y la posterior recuperación de las regiones CH2/CH3 que contienen proteínas de la fase sólida. No obstante, estos esquemas quedan limitados porque las condiciones utilizadas para enlazar las regiones CH2/CH3 que contienen proteínas también enlazan impurezas (p.ej., anticuerpos con regiones CH2/CH3 incompletas) . En el desarrollo de la terapéutica humana, esas impurezas son muy indeseables.

En consecuencia, existe una necesidad de mejoras en la purificación de proteínas o polipéptidos con regiones constantes, en particular, proteínas con regiones Fc (p.ej., anticuerpos) , producidos mediante cultivo celular.

US 2004/229330 revela un método para la captura y purificación altamente eficaz de proteínas etiquetadas desde una preparación proteica, especialmente una proteína etiquetada de baja cantidad.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En varios aspectos, la presente invención ofrece métodos para separar anticuerpos con una región Fc de un líquido fuente que consiste en el anticuerpo y en una o más impurezas. En los métodos de la invención, el anticuerpo con una región Fc (la proteína objetivo) es absorbida a un agente aglutinador Fc que consta de una o más proteína A y Proteína G, y luego el agente aglutinador Fc se lava con una solución búfer con de 0, 5M a 3M CaCI2 para eliminar una o más impurezas. La proteína queda cubierta desde el agente aglutinador Fc en una solución de elución con pH de 2 a 4. Los métodos de la invención son particularmente útiles para eliminar impurezas como especies variables leídas por intrón (IRT) , especies ligadas bajo disulfuro (UDB) y/o especies variables de bajo peso molecular (LMW) . Los métodos de la invención también resultan efectivos en la eliminación de impurezas como las proteínas de célula huésped (HCP) y ADN.

Los métodos de la presente invención incluyen una o más etapas de separación cromatográfica y puede incluir, además, una o más etapas de filtración. Las etapas de separación cromatográfica pueden ser continuas o discontinuas (p.ej., un procesamiento por lotes) , o una combinación de ambas. En varias realizaciones, los métodos incluyen una o más etapas de filtración, por ejemplo, para eliminar virus, concentrar y estabilizar la solución que contiene la proteína objetivo, y para eliminar contaminantes microbianos.

En varias realizaciones, la región Fc con anticuerpos es una fusión de anticuerpos, un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico, o un anticuerpo humanizado. En una realización preferente, la región Fc con contenido de anticuerpos es un anticuerpo humano o humanizado anti-IL-13. Otra posibilidad, en otras realizaciones, es que la región Fc con anticuerpos puede ligar un antígeno como Ap, CD3, CD52, VEGF, EGFR, CD33, CD20, HER-2, TNFa, CD25, RSV, IgE, gp llb/llla, o integrina CD11a o a4.

En varias realizaciones, la región Fc con contenido de anticuerpos se produce por recombinación. En varias realizaciones, la región Fc con contenido de anticuerpos se produce por recombinación en una célula de ovario de hámster chino (CHO) .

En varias realizaciones, uno o más impurezas incluyen una o más proteína de célula huésped, ADN de célula huésped, una proteína de cultivo celular, especies no deseadas del anticuerpo con una región Fc y mezcla entre ellos. Por ejemplo, en varias realizaciones, las especies de anticuerpos no deseadas con una región Fc incluyen uno o más fragmentos o cadenas de anticuerpos con secuencia leída por intrón, uno o más fragmentos o cadenas de anticuerpos con una inadecuada pérdida de disulfida, de un semi-anticuerpo o fragmento, dímero de cadena ligera o fragmento, dímero de cadena pesada o fragmento.

En cierto modo, los métodos de la presente invención purifican un anticuerpo con una región Fc desde un líquido fuente que consta del anticuerpo y una o más impurezas mediante la absorción del anticuerpo a un agente aglutinador Fc que incluye una o más Proteína A y Proteína G seguido de un lavado del agente aglutinador Fc con una solución búfer que contiene de 0, 5M a 3M CaCI2 para eliminar una o más impurezas, y después cubrir la proteína del agente aglutinador Fc en un búfer de elución con pH entre 2-4. En varias realizaciones, las etapas de absorción del anticuerpo a un agente aglutinador Fc y lavado del agente aglutinador Fc con una solución búfer con CaCI2 se realizan con una temperatura entre 2ºC hasta unos 24ºC. La etapa de recuperación del anticuerpo del agente aglutinador Fc incluye eluir la proteína utilizando un búfer de elución con el pH entre 2, 0 a 4.

El agente aglutinador de la región Fc incluye una o más Proteína A y Proteína G. En una realización preferida, el agente aglutinador Fc se inmobilia en una fase sólida. La fase sólida puede incluir, por ejemplo, una o más gotículas de sílice, una matriz de agarosa, y mezclas de ellas.

En diversas realizaciones, la solución búfer con CaCI2 tiene un valor de pH en el intervalo entre aproximadamente 4 a aproximadamente 9, y en algunas realizaciones, entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8, entre aproximadamente 4, 5 y aproximadamente 7, 5 o entre aproximadamente 6 a aproximadamente 8. Los valores y rangos incluidos y / o intermedios dentro de los rangos establecidos en este documento también se pretende que sea dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, el CaCl2 tiene un valor de pH entre aproximadamente 7, 1 a aproximadamente 7, 2 aproximadamente 7, 9, entre aproximadamente 7, 3 a aproximadamente 7, 7, entre aproximadamente 7, 4 a aproximadamente 7, 6, entre aproximadamente 4 a aproximadamente 5, de entre 5 a aproximadamente 6, de entre aproximadamente 6 a aproximadamente 7, o entre aproximadamente 8 a aproximadamente 9.

Además, oscila tener valores citados en esta memoria como un límite superior o inferior se pretende que estén dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, el CaCl2 tiene un pH de al menos aproximadamente (o sobre) 4, 5, 5, 5, 5, 6, 6, 5, 7, 7, 5, u 8.

La solución buffer tiene una concentración de CaCl2 en el intervalo entre aproximadamente 0, 5 M hasta 3M, entre aproximadamente 1, 0 M a aproximadamente 3 M o entre aproximadamente 0, 6 M a aproximadamente 2, 5 M. Por ejemplo, el buffer puede comprender al menos 0, 6 M CaCl2 o al menos 2 M de CaCl2. Los valores y rangos incluidos y / o intermedios dentro de los rangos establecidos en la presente invención. Por ejemplo, la solución buffer tiene una concentración de CaCl2 entre aproximadamente 0, 5 M a aproximadamente 0, 75 M, entre aproximadamente 0, 5 M a aproximadamente 0, 8 M, entre aproximadamente 0, 5 M a aproximadamente 0, 9M, entre aproximadamente 0, 5 M a 1, 0 M, entre aproximadamente 0, 5 M a 2 M, entre aproximadamente... [Seguir leyendo]

. Un método para purificar un anticuerpo con una región Fc a partir de un líquido fuente que consta del anticuerpo y una o más impurezas, con las siguientes etapas:

absorber el anticuerpo hacia un agente aglutinador Fc que consta de una o más Proteínas A y Proteínas G; lavado del agente aglutinador Fc con una solución amortiguadora con CaCI2 en una concentración de 0, 5 M a 3 M para eliminar una o más impurezas; y recuperar el anticuerpo del agente aglutinador Fc mediante la elución del anticuerpo en un búfer de elución con un pH de 2 a 4.

2. El método de la reivindicación 1, donde esas impurezas, una o más, se seleccionan del grupo compuesto por: especies variables leídas por intrón (IRT) , especies ligadas bajo disulfuro (UDB) y especies de bajo peso molecular (LMW) .

3. El método de la reivindicación 2, donde esas impurezas, una o más, es una IRT.

. El método de la reivindicación 1, donde el anticuerpo se selecciona de entre el grupo compuesto por: una fusión de anticuerpos, un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano.

5. El método de la reivindicación 1, donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-IL-13.

6. El método de la reivindicación 1, donde el anticuerpo liga con un antígeno seleccionado de un grupo compuesto por: CD 3, CD52, VEGF, EGFR, CD33, CD20, HER-2, TNFa, CD25, RSV, IgE, gp Ilb/Illa, CD11 y la integrinaa4.

. El método de la reivindicación 1, donde el anticuerpo con una región Fc ha sido producido mediante recombinación.

8. El método de la reivindicación 7, donde el anticuerpo con una región Fc ha sido producido mediante recombinación en la célula de un ovario de hámster chino (CHO) .

9. El método de la reivindicación 1, donde el agente aglutinador Fc se inmoviliza en una fase sólida.

. El método de la reivindicación 9, donde la fase sólida consta de una o más gotículas, un gel, una resina y una partícula.

. El método de la reivindicación 1, donde la solución amortiguadora con CaCI2 tiene un valor de pH entre 4 y

8.

. El método de la reivindicación 1, donde la solución amortiguadora con CaCI2 tiene un valor de pH entre 7, 3 y 7, 7.

. El método de la reivindicación 1, donde la solución amortiguadora tiene una concentración de CaCI2 entre 1, 5 M y 2, 0 M.

. El método de la reivindicación 1, donde la solución amortiguadora incluye 2 M de CaCI2.

. El método de la reivindicación 1, donde las etapas de absorción del anticuerpo hacia un agente aglutinador Fc y de lavado del agente aglutinador Fc se realizan a una temperatura entre 2 y 24ºC.

. El método de la reivindicación 2, donde una o más impurezas forman parte de una proteína de célula huésped, ADN de una célula huésped, una proteína de cultivo celular o de mezclas de ellos.

. El método de la reivindicación 1, donde la etapa de recuperación del anticuerpo a partir del agente aglutinador Fc incluye la elución del anticuerpo utilizando un búfer de elución con un pH entre 2, 5 a 3, 5.

. El método de la reivindicación 1, donde el método incluye además una etapa de cromatografía seleccionada de entre el grupo compuesto por: cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de afinidad metálica inmovilizada y cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) .

. El método de la reivindicación 1, donde el método incluye una etapa de purificación adicional seleccionada de entre el grupo compuesto por: cromatografía de hidroxiapatita, diálisis, cromatografía de afinidad, precipitación de sulfato de ammonio, precipitación de etanol, fase HPLC reversa (RP-HPLC) , e isoenfoque.

. El método de la reivindicación 1, donde una o más impurezas incluyen una o más variables leídas por intrón del anticuerpo y la solución de elución con el anticuerpo tiene un nivel de variables leídas por intrón que es al menos 5 veces inferior al nivel de variables leídas por intrón del líquido fuente.

. El método de la reivindicación 20, donde una solución que contiene el anticuerpo recuperada de la solución de elución tiene un nivel de variables leídas por intrón que es al menos 10 veces inferior al nivel de variables leídas por intrón del líquido fuente.

. El método de la reivindicación 1, donde una o más impurezas incluyen una o más variables leídas por intrón del anticuerpo y las variables leídas por intrón incluyen menos del 1% de una especie de ese anticuerpo en la solución de elución.

. El método de la reivindicación 22, donde las variables leídas por intrón constituyen menos del 0, 8% de una especie de ese anticuerpo en la solución de elución.

. El método de la reivindicación 23, donde las variables leídas por intrón constituyen menos del 0, 5% de una especie de ese anticuerpo en la solución de elución.

. El método de la reivindicación 24, donde las variables leídas por intrón constituyen menos del 0, 2% de una especie de ese anticuerpo en el líquido de elución.

. El método de la reivindicación 1, donde una o más impurezas incluyen una o más especies de bajo peso molecular del anticuerpo y las especies de bajo peso molecular constituyen menos del 1% de un tipo de ese anticuerpo en la solución de elución.

. El método de la reivindicación 26, donde las especies de bajo peso molecular representan menos del 0, 8% de una especie de ese anticuerpo en la solución de elución.

. El método de la reivindicación 27, donde las especies de bajo peso molecular representan menos del 0, 5% de una especie de ese anticuerpo en la solución de elución.

. El método de la reivindicación 28, donde las especies de bajo peso molecular representan menos del 0, 2% de una especie de ese anticuerpo en la solución de elución.

. El método de la reivindicación 1, donde una o más impurezas incluyen una o más variables ligadas bajo disulfuro del anticuerpo y las variables ligadas bajo disulfuro representan menos del15% de una especie de ese anticuerpo en la solución de elución.

. El método de la reivindicación 30, donde las variables ligadas bajo disulfuro representan menos del 10% de un tipo de ese anticuerpo en la solución de elución.

. El método de la reivindicación 31, donde las variables ligadas bajo disulfuro representan menos del 5% de un tipo de ese anticuerpo en la solución de elución.

. El método de la reivindicación 32, donde las variables ligadas bajo disulfuro representan menos del 2% de un tipo de ese anticuerpo en la solución de elución.