Métodos para fototransfectar ácido nucleico en células vivas.

Metodo in vitro de transferencia de un fenotipo multigenico a una celula,

comprendiendo dicho metodoirradiar dicha celula con un laser, en el que se baña dicha celula en un medio fluido que comprende dos omas acidos nucleicos aislados diferentes que tienen dos o mas secuencias de nucleótidos diferentes, en elque al menos un acido nucleico aislado es ARNm, en el que dicho laser crea un poro en una membranacelular de dicha celula y dichos acidos nucleicos entran en dicha celula, y en el que dicho ARNm se expresapor dicha celula, transfiriendo asi un fenotipo multigenico a una celula.

Métodos para fototransfectar ácido nucleico en células vivas Antecedentes de la invención Una grave desventaja de las estrategias de terapia génic:a actuales y los métodos convencionales de introducción de macromoléculas, particularmente ácidos nucleicos, en c:élulas es la incapacidad de las combinaciones de vector y sistema de suministro para suministrar eficazmente ác:idos nucleicos al interior de las células de una población seleccionada como diana. Los métodos para introducir macromoléculas, particularmente ácido nucleico, en una célula individual o un grupo de células son diversos. Los métodos usados comúnmente incluyen tratamientos químicos, transfección mediada por liposoma, microiroyección, electroporación y bombardeo de partículas. Sin embargo, estas técnicas pueden requerir mucho tiemp;o y presentan bajos rendimientos o escasa supervivencia celular, y no todos los tipos de células pueden tratarse rnediante estos métodos de introducción de macromoléculas en una célula.

Se conocen muchas composiciones y métodos para suministrar un ácido nucleico a un tejido o célula de animal. Tales composiciones incluyen ácidos nucleicos "desnudos" (es decir no complejados) , ácidos nucleicos complejados con moléculas catiónicas tales como polilisina o lipides que forman liposomas, y vectores de virus. Los ácidos nucleicos desnudos pueden captarse por diversas células de animales, pero se someten a nucleolisis, tanto dentro como fuera de las células que los captan. Para superar la nucleolisis se usan análogos de ácido nucleico que son relativamente resistentes a la nucleolisis, incluyendo an{llogos de ácido nucleico fosforotioato. Sin embargo, cuando se desea la incorporación del ácido nucleico en el genoma de la célula diana, el uso de análogos de ácido nucleico es de uso limitado.

También se han descrito numerosos vectores que comprenden un acido nucleico complejado con un compuesto para mejorar la estabilidad o la caplación del ácido nucleico por una célula diana. Tales compuestos incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, policationes tales como di, etilaminoetildexlrano, polilisina o Polybrene, y lipidos que forman liposomas tales como bromuro de didocilmetilslmonio y Lipofectamine®. Sin embargo, las transfecciones tradicionales con un vector de ADN complejado con otra composición limitan gravemente la capacidad para controlar la cantidad de transcripción de ARNm o expresión dE! protelna, dando como resultado niveles no naturales de expresión de proteína que no pueden controlarse de otro modo.

Los vectores de virus se consideran generalmente los vectores de ácido nucleico más eficaces. Con frecuencia se usan vectores de virus defectuosos para la replicación, recombinantes, para Iransducir (es decir, infectar) células de animales. Tales vectores han incluido vectores de retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados y vectores de herpesvirus. Aunque .son altamente eficaces para la transferencia génica, una desventaja principal asociada con el uso de vectores de virus es la incapacidad de muchosveclores de virus para infectar a células que no se dividen, limitando los tipos de célula que pueden lransfeclarse. Además, si no se desea la integración de un ácido nucleico en el genoma, no se recomiendan determinados virus, tales como veclores de relrovirus. Además, con frecuencia hay un limite de tamaño para la longitud del gen o AONc que puede introducirse en un vector. Además, los vectores génicos de virus no permiten una regulación apropiada de la expresión génica a lo largo del tiempo en células transfectadas.

El documento WO 20051044367 da a conocer un mét () do de introducción y liberación de suslancias, lales como ácidos nucleicos, dentro y fuera de células usando un láser. El documento WO 20051044367 no menciona la transfecdón de ARNm y, además, no propone un método para transferir un fenotipo multigénico que comprenda la introducción de dos o más tipos diferentes de ácidos nucleicos.

A pesar del desarrollo y la refinación de las técnicas comentadas anteriormente, sigue existiendo una necesidad en la técnica de métodos y composiciones que puedan USé:lrse para potenciar el suministro de un ácido nucleico a una célula deseada que va a transfectarse con el ácido nuclleico. Además, las técnicas comentadas anleriormente están limitadas a suministrar uno o tan sólo unos pocos ácidos nucleicos para estudiar la expresión de estos números limitados de ácidos nucleicos sobre un fenotipo celular. La presente invención proporciona un mélodo novedoso de transferencia de un fenotipo multigénico a una célula.

Breve sumario de la invención La presente invención se refiere a los siguientes puntos:

1. Un método in vitro de transferencia de un fenotipo multigénico a una célula , comprendiendo dicho método irradiar dicha célula con un láser, en el que se baña dicha célula en un medio fluido que comprende dos o más ácidos nuc!eicos aislados diferenles que lienen dos o más secuencias de nucleótidos diferentes, en el que al menos un ácido nucleico aislado es ARNm, en el que dicho lésel' crea un poro en una membrana celular de dicha célula y dichos ácidos nucleicos entran en dicha célula, y en el que dicho ARNm se expresa por dicha célula, transfiriendo asl un fenotipo multigénico a una célula.

2. El método del punlo 1, en el que dichos ácidos nucleic:os aislados comprenden al menos un ARN seleccionado del

grupo que consiste en ARNip, miARN, ARNnh, ARNt y combinaciones de los mismos.

3. El método del punto 1, en el que dicha célula se selecciona del grupo que consisle en una célula eucariota y una célula procariota.

4. El método del punto 3, en el que dicha célula eucariot~1 no es una célula de mamífero.

5. El método del punto 1, en el que dicha célula es una oélula vegetal.

6. El método del punto 1, en el que dicha célula es un protozoo.

7. El método del punto 1, en el que dichos ácidos nucleicos se aislan a partir de una célula.

8. El método del punto 1, en el que dichos ácidos nuclei, CQs aislados se preparan mediante un método seleccionado del grupo que consiste en aislamiento de ARNm a partir de una célula, transcripción in vitro o síntesis química.

9. El método del punto 1, en el que dichos ácidos nucleicos codifican para dos o más polipéptidos diferentes.

10. El método del punto 1, en el que dichos ácidos nucleicos aislados comprenden una combinación de ARN y ADN.

11. El método det punto 1, en el que dichos ácidos nucleicos aislados comprenden una mezcla de ARN diferentes que codifican para dos o más polipéptidos diferentes, Em el que la abundancia relativa de cada ARN diferente es esencialmente la misma que la abundancia relativa de cada ARN diferente en una segunda célula que está en un estado fisiológico diferente del de la célula irradiada.

12. El método del punto 9, en el que dichos ácidos nucleicos aislados comprenden además un ácido nucleico inhibidor.

13. El método del punto 1, en el que dicho láser es un láser de titanio-zafiro.

14. El método del punto 1, en el que dicho medio fluido es un liquido.

15. El método del punto 1, en el que dicha célula se baria con dicho medio fluido que comprende dos o más ácidos nucleicos aislados en una ubicación diferenciada sobre la superficie de la célula.

16. El método del punto 1, en el que la célula comprende: una dendrita.

17. El método del punto 14, en el que dicho láser es un lé~ser de titanio-zafiro.

18. El método del punto 14, en el que dicho medio fluido es un liquido.

19. El método del punto 14, en et que dicha célula es uné! célula individual.

Todavla en otra realización, los ácidos nucleicos aislados se seleccionan del grupo que consiste en ARN, ADN Y combinaciones de los mismos. En otra realización, el ARN se selecciona del grupo que consiste en ARNm, ARNip, miARN, ARNnh, ARNt y

combinaciones de los mismos. Aún en otra realización, los ácidos nucleicos aislados comprenden una mezcla de ARN diferentes que codifican para dos o más polipéptidos diferentes, en la que la abundancia relativa de cada ARN diferente es esencialmente la

misma que la abundancia relativa de cada ARN diferen'le en una segunda célula que está en un estado fisiológico diferente del de la célula irradiada. En otra realización, los ácidos nucleicos aislados compre'nden además un ácido nucleico inhibidor. En una realización, el láser es un láser de titanio-zafiro. Todavla en otra realización, el medio fluido es un liquido. Todavia en otra realización, la célula se baria con el medio fluido que comprende dos o más acidos nucleicos

aislados... [Seguir leyendo]

1. Método in vitro de transferencia de un fenotipo mulligénico a una célula, comprendiendo dicho método irradiar dicha célula con un láser, en el que se baña dicha célula en un medio fluido que comprende dos o más ácidos nudeicos aislados diferentes que tienen dos o más secuencias de nudeótidos diferentes, en el que al menos un ácido nucleico aislado es ARNm, en el que dicho láser crea un poro en una membrana celular de dicha célula y dichos ácidos nucleicos entran en dicha célula, y en el que dicho ARNm se expresa por dicha célula, transfiriendo asi un fenotipo multigénico a una célula.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dictloS ácidos nucleicos aislados comprenden al menos un ARN seleccionado del grupo que consiste en ARNip, miARN, ARNnh, ARNt y combinaciones de los mismos.

3. Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en una célula eucariota y una célula procariota.

4. Método según la reivindicación 3, en el que dicha célula eucariota no es una célula de mamífero.

5. Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula es una célula vegetal.

6. Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula es un protozoo.

7. Método según la reivindicación 1, en el que dichos acidos nucleicos se aislan a partir de una célula.

8. Método según la reivindicación 1, en el que dichos ácidos nucleicos aislados se preparan mediante un método seleccionado del grupo que consiste en aislamiento de ARNm a partir de una célula, transcripción in vitre o slntesis qulmica.

9. Método según la reivindicación 1, en el que dichos ácidos nucleicos codifican para dos o más polipéptidos diferentes.

10. Método según la reivindicación 1, en el que did10s ácidos nucleicos aislados comprenden una combinación de ARN Y AON.

. Método según la reivindicación 1, en el que di, ehos ácidos nucleicos aislados comprenden una mezda de ARN diferentes que codifican para dos o más polipéptidos diferentes, en el que la abundancia relativa de cada ARN diferente es esencialmente la misma que la abundancia relativa de cada ARN diferente en una segunda célula que está en un estado fisiológico diferente del de la célula irradiada.

12. Método según la reivindicación 9, en el que dichos ácidos nucleicos aislados comprenden además un ácido nudeico inhibidor.

13. Método según la reivindicación 1, en el que dicho táser es un láser de titanio-zafiro.

14. Método según la reivindicación 1, en el que dictlo medio fluido es un liquido.

15. Método según la reivindicación 1, en el que dic~la célula se batla con dicho medio fluido que comprende dos

o mas acidos nucleicos aislados en una ubicación diferenciada sobre la superficie de la célula.

16. Método según la reivindicación 1, en el que la célula comprende una dendrita.

17. Método según la reivindicación 14, en el que dicho láser es un láser de titanio-zafiro.

18. Método según la reivindicación 14, en el que dicho medio fluido es un liquido.

19. Método según la reivindicación 14, en el que dicha célula es una célula individual.