Métodos de identificación sistemática que usan insectos con barrera hematoencefálica.

Un método para evaluar si un compuesto químico se puede transportar a través de la barrera hematoencefálica(BHE) de un vertebrado,

preferentemente un mamífero, tal como un ser humano, y dicho método comprende lasetapas de:

• administrar el compuesto químico a un insecto que tiene una BHE,

• incubar los insectos,

• diseccionar cerebros de los insectos, y

• medir la concentración del compuesto químico en los cerebros.

Métodos de identificación sistemática que usan insectos con barrera hematoencefálica

Campo de la invención La presente invención se dirige a modelos de insectos que están destinados a reflejar la penetración de la barrera hematoencefálica de los vertebrados (BHE) . La investigación de la penetración de la BHE es extremadamente importante en el descubrimiento de fármacos; los fármacos satisfactorios para el SNC tienen que atravesar la BHE, mientras que la penetración de la BHE puede causar efectos secundarios no deseados para fármacos de acción periférica. Específicamente, la presente invención se refiere al uso de insectos en la identificación sistemática de sustancias con un efecto biológico sobre el cerebro o el sistema nervioso central y/o efecto en una enfermedad o trastorno del cerebro o del sistema nervioso central. Además, se refiere al uso de dichos insectos en la identificación sistemática de sustancias que tienen una actividad biológica deseada y que no cruzan la barrera hematoencefálica.

Antecedentes de la invención El descubrimiento de fármacos es un asunto costoso en el que uno de los mayores gastos en términos económicos y de tiempo es el estudio in vivo. Para reducir estos costes, un gran número de modelos in vitro se desarrollan y se aplican como filtros para seleccionar los compuestos más adecuados para los estudios in vivo. Sin embargo, los modelos in vitro a menudo son demasiado simplificados y, como tal, pueden inducir a error en el proceso de toma de decisiones. Por lo tanto, existe una demanda de modelos intermedios que sean más fiables que los modelos in vitro y que al mismo tiempo sean más rápidos y más baratos que los modelos tradicionales de vertebrados in vivo. Los insectos pueden servir a esta función y las moscas de la fruta se usan actualmente como modelos farmacodinámicos intermedios (PD) por EnVivo Pharmaceuticals Inc., que desarrolla fármacos para el SNC

Existen varios problemas con los ensayos in vitro existentes. Es imposible realizar ensayos in vitro para justificar todos los sucesos biológicos que se producen in vivo. Hay sucesos biológicos que todavía no se entienden o deficiencias en los ensayos in vitro existentes, por ejemplo, los ensayos pueden carecer de las características importantes que están presentes in vivo, que incluyen moléculas de transportadores activos, enzimas metabólicas, o incluso sucesos biológicos imprevistos. A pesar de las deficiencias evidentes, los modelos in vitro se usan intensivamente en el proceso de descubrimiento de fármacos en el que la mayor parte de las compañías farmacéuticas usan grandes baterías de identificaciones sistemáticas in vitro. Los compuestos de ensayo en un gran número de ensayos in vitro no siempre pueden reflejar el comportamiento in vivo. De hecho, no es inusual que los compuestos que tienen perfiles aceptables in vitro resulten que tengan perfiles inadecuados in vivo. Por el contrario, los compuestos se pueden descartar por razones erróneas. Por lo tanto, existe una necesidad de modelos in vitro/in vivo intermedios, que podrían apoyar la investigación de descubrimiento de fármacos con mejores datos y por lo tanto reducir el número de experimentos in vivo de coste elevado.

Los modelos in vitro se usan con la suposición de que cada uno de los modelos refleja un solo suceso biológico in vivo y aislado. Sin embargo, el gran número de modelos in vitro que se usan en la fase de descubrimiento (Ruiz-Garcia y col. 2007) tienen como objetivo reflejar la complejidad de la biología in vivo en la que se producen numerosos sucesos biológicos en múltiples compartimentos. Una limitación principal debida al uso de muchos modelos in vitro es la falta de interacción entre diferentes sucesos biológicos y la interacción entre diferentes 45 compartimentos. Sin embargo, una ventaja principal del uso de insectos como modelos intermedios es que estos modelos cumplen el requisito de una interacción compleja no solamente entre diferentes componentes de la estructura de la barrera cerebral sino también entre los diferentes compartimentos que aparecen en los insectos ya que son especies vivas con compartimentos que en gran medida son similares a los de los vertebrados.

La barrera hematoencefálica de los vertebrados (BHE) representa la barrera fisiológica entre el tejido cerebral y los vasos sanguíneos, que limita el intercambio de solutos y regula la absorción de agentes exogénicos (por ejemplo fármacos) de la sangre en el cerebro. La función del sistema nervioso central (SNC) requiere un entorno extracelular altamente regulado. Anatómicamente, la BHE de los vertebrados está compuesta de células endoteliales microvasculares interconectadas a través de puntos de unión estrechos altamente especializados (TJ) , que 55 proporcionan una barrera de difusión y de este modo desempeñan un papel central para la permeabilidad. Componentes identificados recientemente de los TJ incluyen las claudinas, una familia de proteínas de cuatro segmentos transmembrana que se sugieren como responsables en la función de la barrera de los TJ (Turksen y Troy 2004) . La penetración de la BHE es uno de los principales obstáculos en el desarrollo de fármacos satisfactorios para el SNC. Por otro lado, cuando se produce la penetración de la BHE, puede provocar efectos secundarios no deseados para los fármacos de actuación periférica (Schinkel 1999) (para una revisión, véase Pardridge 2002) .

La penetración de la BHE normalmente se clasifica como basada en química o en biología. La penetración basada en la química está unida a la difusión pasiva mediada por lípidos, que depende de las propiedades fisicoquímicas de 65 la molécula, es decir, las moléculas hidrofóbicas pequeñas tienden a penetrar la BHE más fácilmente que las moléculas grandes e hidrófilas. La penetración basada en la biología implica compuestos que son sustratos para los sistemas de transporte de influjo o eflujo de la BHE endógena, por ejemplo, muchas moléculas pequeñas (por ejemplo fármacos) han demostrado que son sustratos para el transportador de glicoproteína P (P-gp) . Los P-gp son proteínas transportadoras ubicadas en las paredes de las células que componen la BHE (Schinkel 1999) y que se conservan entre taxones tan diversos como protozoos, plantas, insectos y mamíferos (en Gaertner y col. 1998) . Los P-gp están presentes en muchos tipos de células y desempeñan papeles importantes en la absorción, disposición, metabolismo, y toxicidad de fármacos (Xia y col. 2006) .

Evidentemente, es fundamental tener una comprensión de la penetración de la BHE en los proyectos de descubrimiento de fármacos y preferentemente, ésto se debería obtener sin usar un número excesivo de estudios in vivo. En consecuencia, se desarrollan varios modelos de absorción de la BHE in vitro para predecir el comportamiento in vivo de los compuestos de ensayo. Sin embargo, incluso los modelos complejos in vitro que incluyen los sistemas transportadores de P-gp (Di y Kerns 2003, Summerfield y col. 2005) parece que no cumplen con la intrincada complejidad de los TJ y por lo tanto no pueden describir muy bien el comportamiento in vivo. Esto está muy indicado en un estudio extenso de absorción de la BHE, en el que se sometieron a ensayo 22 compuestos en diez modelos diferentes de absorción de la BHE in vitro (Garberg 2005) . Ninguno de los diez modelos mostraron correlación alguna entre la permeabilidad in vitro e in vivo. Esto indica que los modelos específicos de la BHE no proporcionan necesariamente mejor predicción que los modelos que no derivan de la BHE. Además, se sugirió que la unión a proteínas, flujo sanguíneo, estabilidad metabólica y lipofilia, así como la afinidad por otros transportadores en la BHE son factores necesarios a tener en consideración cuando se van a hacer predicciones de distribución cerebral in vivo. En consecuencia, parece que los modelos in vitro son adecuados principalmente para medidas cualitativas de compuestos que atraviesan la BHE por difusión pasiva o compuestos que experimentan eflujo a través del transportador de P-gp (Garberg 2005) .

Determinados invertebrados han servido como modelos útiles para la comprensión de muchos procesos biológicos diferentes. Especialmente la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster es un organismo de investigación modelo bien reconocido, que ha hecho contribuciones significativas en la comprensión de la genética, neurobiología, biología molecular, etc. (Gullan y Cranston 2000) . Generalmente, los insectos y los vertebrados tienen muchas características fisiológicas en común. Son organismos pluricelulares con sistemas nerviosos compartimentados complejos para funciones especializadas como la visión, olfato, aprendizaje, y memoria. Los sistemas nerviosos de los... [Seguir leyendo]

1. Un método para evaluar si un compuesto químico se puede transportar a través de la barrera hematoencefálica (BHE) de un vertebrado, preferentemente un mamífero, tal como un ser humano, y dicho método comprende las 5 etapas de:

• administrar el compuesto químico a un insecto que tiene una BHE,

• incubar los insectos,

• diseccionar cerebros de los insectos, y 10 • medir la concentración del compuesto químico en los cerebros.

2. El método de la reivindicación 1, en el que los insectos están seleccionados entre el grupo que consiste en los órdenes Blattodea, Diptera, Acridoidea, Cheleutoptera, Brachycera y Lepidoptera.

3. El método de la reivindicación 1, en el que los insectos se incuban durante un periodo de entre 0, 5 horas y 5 horas antes de diseccionar los cerebros de los insectos con un punto de vista de cuantificación de la concentración del compuesto químico administrado en los cerebros.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la disección de los cerebros se realiza inmediatamente después de 20 sacrificar a los insectos.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la medida de la concentración del compuesto químico se realiza mediante homogeneización de los cerebros diseccionados, preferentemente por centrifugación del homogenado y analizando la concentración del compuesto químico en el homogenado mediante cromatografía líquida,

posiblemente con detección espectrométrica de masas de los compuestos eluidos.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el compuesto químico se administra por vía parenteral o por vía oral.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende la determinación de gradientes de concentración de compuesto químico cuerpo:cerebro para determinar cuantitativamente la penetración de la BHE.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende comparar las eficacias relativas de compuestos químicos con la actividad deseada en el sistema nervioso central en presencia de una barrera hematoencefálica.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende determinar si un compuesto químico se metaboliza en la barrera hematoencefálica. 40

10. Uso de insectos seleccionados entre el grupo que consiste en los órdenes Blattodea, Diptera, Acridoidea, Cheleutoptera, Brachycera y Lepidoptera para evaluar si un compuesto químico se transporta a través de la barrera hematoencefálica de un vertebrado, preferentemente un mamífero, tal como un ser humano.