Métodos de determinación de la eficacia de los tratamientos de enfermedades inflamatorias del colon.

Un método in vitro de selección de composiciones probióticas según su eficacia en el tratamiento de enfermedades inflamatorias del colon que comprende las etapas de:

a) tratar una muestra biológica que comprende, al menos, un tipo celular intestinal con la composición probiótica in vitro;

b) medir el nivel de, al menos, una citoquina antiinflamatoria y, al menos, una citoquina proinflamatoria en la muestra biológica después del tratamiento con la composición probiótica;

c) determinar la relación de, al menos, una citoquina antiinflamatoria a, al menos, una citoquina proinflamatoria en la muestra biológica después del tratamiento con la composición probiótica;

caracterizado por que una relación determinada según la etapa (c) de la muestra biológica tratada superior a la misma relación determinada en una muestra biológica de control sin tratar sometida a ensayo al mismo tiempo indica que la composición probiótica inhibe las enfermedades inflamatorias del colon, y una relación determinada según (c) igual o inferior a la relación de la muestra biológica de control sin tratar indica que la composición probiótica no inhibe las enfermedades inflamatorias del colon; en el que dicha relación de citoquina antiinflamatoria a citoquina proinflamatoria es la relación interleucina 10/interleucina-12.

Métodos de determinación de la eficacia de los tratamientos de enfermedades inflamatorias del colon

Campo técnico La presente invención se refiere al campo de las enfermedades inflamatorias del colon, especialmente a métodos de selección y de determinación de la eficacia de los tratamientos de estas enfermedades.

Antecedentes Enfermedades inflamatorias del colon es el término general utilizado para las enfermedades que ocasionan inflamación del intestino como, por ejemplo, el síndrome del intestino irritable (SII) , y las enfermedades inflamatorias del colon (EII) tales como la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn, que son trastornos inflamatorios crónicos del tracto gastrointestinal (GI) . La colitis ulcerosa, por ejemplo, es una enfermedad inflamatoria intestinal que ocasiona inflamación de la mucosa que recubre el intestino grueso y que se produce, generalmente, en el recto y en la parte inferior del colon, pero que afecta al colon entero. La enfermedad de Crohn puede afectar a cualquier zona del tracto gastrointestinal (es decir, a la boca, al esófago, al estómago, al intestino delgado, al intestino grueso, al recto y al ano) , y puede afectar a todas las capas de la pared intestinal. La causa de muchas de estas enfermedades es desconocida.

El síndrome del intestino irritable es un trastorno funcional del tracto gastrointestinal en el que se producen molestias o dolor abdominal asociados con la defecación o con cambios en el movimiento intestinal, y que presenta signos de trastornos en los patrones de deposición. Estos síntomas suponen una condición en la que las irregularidades en la función motora y/o sensorial del intestino pueden estar asociadas con trastornos psicosociales, y la interacción da lugar a síntomas del tracto gastrointestinal de diferente intensidad.

El síndrome del intestino irritable se considera hoy en día el trastorno gastrointestinal más habitual. Se estima que, en occidente, la tasa de prevalencia es de 15%-20% de la población adolescente y adulta, y el trastorno representa el 20%-50% de las consultas en clínicas gastroenterológicas.

Los métodos empleados para el síndrome del intestino irritable consisten en la identificación de los síntomas característicos del síndrome y en excluir las enfermedades orgánicas con manifestaciones similares, seguido de terapias farmacológicas y no farmacológicas, según resulte apropiado. Las opciones terapéuticas farmacológicas actuales son limitadas y la eficacia de muchas de dichas opciones está escasamente documentada. Las terapias farmacológicas habituales van encaminadas a tratar los síntomas, siendo el objetivo modular la motilidad intestinal, disminuir la hipersensibilidad del vientre o tratar los trastornos asociados, especialmente la ansiedad o la depresión.

Los síntomas más habituales de la enfermedad inflamatoria intestinal incluyen dolor abdominal, tenesmo, urgencia fecal y diarrea sanguinolenta. Las personas que la padecen pueden también experimentar fatiga, pérdida de peso, pérdida de apetito, sangrado rectal y pérdida de fluidos corporales y de electrolitos. Los síntomas de la enfermedad son generalmente progresivos y las personas que la padecen experimentan, de forma típica, períodos de remisión seguidos de severas recaídas.

A pesar de la prevalencia de la enfermedad inflamatoria intestinal (se estima que, solo en Estados Unidos, afecta a 2 millones de personas) , no existe cura y todavía no se conocen las causas exactas de la enfermedad. Los tratamientos convencionales de la enfermedad inflamatoria intestinal utilizados hasta la fecha incluyen medicamentos antiinflamatorios, medicamentos inmunosupresores y tratamientos quirúrgicos. Sin embargo, muchos de los medicamentos usados para tratar la enfermedad tienen efectos secundarios negativos tales como náuseas, mareo, anemia, leucopenia, erupciones cutáneas y adicción a los medicamentos, y los procedimientos quirúrgicos son, a menudo, procedimientos radicales tales como la resectomía intestinal y la colectomía.

Por este motivo, diversos investigadores han intentado identificar medicamentos nuevos y novedosos para tratar las enfermedades inflamatorias del colon. Desgraciadamente, la propia naturaleza de la enfermedad hace que sea muy difícil llevar a cabo una selección y determinación de la eficacia de los posibles tratamientos en pacientes humanos. A menudo, esto hace que los ensayos en humanos dependan del testimonio subjetivo de los propios candidatos, con pocos o en ausencia de datos bioquímicos o fisiológicos que avalen las reivindicaciones. Pueden usarse modelos animales para poder tomar secciones de tejido de los órganos afectados, pero las drogas que son eficaces en modelos animales no siempre tienen la misma eficacia en los humanos.

El control de las enfermedades inflamatorias del colon se lleva a cabo a diferentes niveles. Los factores de control incluyen hormonas, prostaglandinas, productos intermedios con oxígeno y nitrógeno reactivo, leucotrienos y citoquinas. Las citoquinas son proteínas biológicamente activas de bajo peso molecular involucradas en la generación y en el control de las respuestas inmunológicas e inflamatorias. Las citoquinas son producidas por diversos tipos de célula, siendo los neutrófilos, los monocitos y los linfocitos las fuentes principales durante las reacciones inflamatorias debido a su mayor número en la zona lesionada.

Existen mecanismos múltiples por los cuales las citoquinas generadas en las zonas de inflamación afectan a la respuesta inflamatoria. La quemotaxis estimula el anidamiento de las células inflamatorias en la zona lesionada, mientras que determinadas citoquinas favorecen la infiltración de las células en el tejido. Las citoquinas liberadas en el tejido lesionado dan lugar a la activación del infiltrado inflamatorio. La mayoría de las citoquinas son pleiotrópicas y expresan múltiples actividades que se solapan desde el punto de vista biológico. Las cascadas y redes de citoquina controlan la respuesta inflamatoria y no la acción de una citoquina en concreto en un tipo celular en concreto. Puesto que las respuesta inflamatorias incontroladas pueden ocasionar enfermedades tales como enfermedades inflamatorias del colon, es razonable suponer que la producción de citoquinas está alterada en los individuos que padecen dichas enfermedades. Sin embargo, puesto que muchas citoquinas pueden tener actividades tanto proinflamatorias como antiinflamatorias, es muy difícil atribuir síntomas de la enfermedad, o de recuperación, a partir de una citoquina determinada.

Teniendo en cuenta lo anterior, es deseable proporcionar métodos de selección y de medida de la eficacia de los posibles tratamientos de las enfermedades inflamatorias del colon en los humanos o en otros mamíferos que generen datos bioquímicos y fisiológicos. Estos datos podrían usarse para evaluar la eficacia del tratamiento. Es deseable además proporcionar métodos para medir los cambios en los niveles de citoquinas específicas potencialmente involucradas en la patogénesis de las enfermedades inflamatorias del colon que permitan hacer un seguimiento constante del pronóstico y del avance de la enfermedad en un paciente con enfermedad inflamatoria intestinal.

Sumario La presente invención proporciona un método in vitro de selección de composiciones probióticas según su eficacia en el tratamiento de las enfermedades inflamatorias del colon que comprende las etapas de:

a) tratar una muestra biológica que comprende al menos un tipo celular intestinal con la composición probiótica in vitro;

b) medir el nivel de, al menos, una citoquina antiinflamatoria y, al menos, una citoquina proinflamatoria en la muestra biológica después del tratamiento con la composición probiótica;

c) determinar la relación de, al menos, una citoquina antiinflamatoria a, al menos, una citoquina proinflamatoria en la muestra biológica después del tratamiento con la composición probiótica;

caracterizado por que una relación determinada según la etapa (c) de la muestra biológica tratada superior a la misma relación determinada en una muestra biológica de control sin tratar sometida a ensayo al mismo tiempo indica que la composición probiótica inhibe las enfermedades inflamatorias del colon, y una relación determinada según (c) igual o inferior a la relación de la muestra biológica de control no tratada indica que la composición probiótica no inhibe las enfermedades inflamatorias del colon;

en el que dicha relación de citoquina antiinflamatoria a citoquina proinflamatoria es la relación interleucina10/interleucina-12.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 es un gráfico de barras que muestra la relación media de IL-10 a IL-12... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro de selección de composiciones probióticas según su eficacia en el tratamiento de enfermedades inflamatorias del colon que comprende las etapas de:

a) tratar una muestra biológica que comprende, al menos, un tipo celular intestinal con la composición probiótica in vitro;

b) medir el nivel de, al menos, una citoquina antiinflamatoria y, al menos, una citoquina proinflamatoria en la muestra biológica después del tratamiento con la composición probiótica;

c) determinar la relación de, al menos, una citoquina antiinflamatoria a, al menos, una citoquina proinflamatoria en la muestra biológica después del tratamiento con la composición probiótica;

caracterizado por que una relación determinada según la etapa (c) de la muestra biológica tratada superior a la misma relación determinada en una muestra biológica de control sin tratar sometida a ensayo al mismo tiempo indica que la composición probiótica inhibe las enfermedades inflamatorias del colon, y una relación determinada según (c) igual o inferior a la relación de la muestra biológica de control sin tratar indica que la composición probiótica no inhibe las enfermedades inflamatorias del colon;

en el que dicha relación de citoquina antiinflamatoria a citoquina proinflamatoria es la relación interleucina10/interleucina-12.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica comprende tejido linfoide asociado con el intestino.

3. El método de la reivindicación 2, en el que el tejido linfoide asociado con el intestino comprende células del nodo linfático mesentérico.

4. El método según las reivindicación 1 que comprende la etapa adicional de estimular la muestra biológica in vitro antes de la etapa (b) .

5. El método según la reivindicación 4, en el que dicha estimulación in vitro comprende un mitógeno, un probiótico, una molécula anti CD3, y mezclas de los mismos.

6. El método según la reivindicación 5, en el que dicha estimulación in vitro comprende un mitógeno.

7. El método según la reivindicación 6, en el que dicho mitógeno comprende un lipopolisacárido, lectina, superantígeno, y mezcla de los mismos.

8. El método según la reivindicación 7, en el que dicha lectina comprende concanavalina A, fitohemaglutinina, mitógeno de Phytolacca, y mezclas de los mismos.

9. El método según la reivindicación 1, en el que los medios de medición de los niveles de dicha, al menos, una citoquina antiinflamatoria en dicha muestra biológica comprenden técnicas ELISA, análisis radioinmunológicos, técnicas de ELISA múltiple sobre plataformas de micromatrices, técnicas de ELISA múltiple con uso de microesferas codificadas en acoplamiento con sistemas de detección mediante citometría de flujo, análisis biológicos, transferencias Western, sistemas de separación mediante cromatografía, RT-PCR, PCR de transcripción inversa competitiva, transferencias Northern, matrices de gen, medición directa de m-RNA, y mezclas de los mismos.

10. El método según la reivindicación 9, en el que los medios de medición de los niveles de citoquinas antiinflamatorias en dicha muestra biológica comprenden técnicas ELISA, técnicas de RIA, técnicas de ELISA múltiple con uso de microesferas codificadas en acoplamiento con sistemas de detección mediante citometría de flujo, y mezclas de los mismos.

11. El método según la reivindicación 10, en el que los medios de medición de los niveles de dicha, al menos, una citoquina antiinflamatoria en dicha muestra biológica comprenden técnicas de ELISA múltiple con uso de microesferas codificadas en acoplamiento con sistemas de detección mediante citometría de flujo.

12. El método según la reivindicación 11, en el que los medios de medición de los niveles de dicha, al menos, una citoquina proinflamatoria en dicha muestra biológica comprenden técnicas ELISA, técnicas de RIA, técnicas de ELISA múltiple con uso de microesferas codificadas en acoplamiento con sistemas de detección mediante citometría de flujo, y mezclas de los mismos.

13. El método según la reivindicación 12, en el que los medios de medición de los niveles de dicha, al menos, una citoquina proinflamatoria en dicha muestra biológica comprenden técnicas de ELISA múltiple con uso de microesferas codificadas en acoplamiento con sistemas de detección mediante citometría de flujo.