Métodos de detección de S. aureus resistente a meticilina, así como cebadores, sondas y kits para los mismos.

Método de detección de la presencia o ausencia de S. aureus resistente a meticilina (SARM) en una muestra,

comprendiendo el método:

(a) la realización de una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con un conjunto decebadores de SARM con el fin de producir un producto amplificación en el caso de que SARM se encuentrepresente en la muestra,

(b) la realización de una etapa de hibridación que comprende poner en contacto el producto de amplificación de laetapa (a) con una pareja de sondas de SARM, en la que una primera sonda de SARM se marca con una pareja desondas de SARM con una fracción fluorescente donadora y en la que una segunda sonda de SARM de la pareja desondas de SARM se marca con una fracción fluorescente aceptora correspondiente, y

(c) la detección de la presencia o ausencia de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) entre lafracción fluorescente donante de la primera sonda de SARM y la fracción fluorescente aceptora de la segunda sondade SARM, en la que la presencia de FRET es indicativa de la presencia de SARM en la muestra, y en la que laausencia de FRET es indicativa de la ausencia de SARM en la muestra,en el que el método es capaz de detectar cada uno de los casetes cromosómicos estafilocócicos (SCCmec) de tiposI a V del SARM, y

en el que el conjunto de cebadores comprende:

(i) un cebador específico para SARM tipo RE2, es decir, un cebador que consiste de la secuencia de ácidosnucleicos 5'-TGA

AAT GAA AGA CTG CGG AG -3' (SARM directo RE2 sentido; SEC ID nº 92);

y

(ii) un cebador específico para SARM tipo RE3, es decir un cebador que consiste de la secuencia de ácidosnucleicos 5'-CCA CAT CTC ATT AAA TTT TTA AAT TAT ACA C -3' (SARM directo RE3 sentido; SEC ID nº 93);

y

(iii) un cebador específico para SARM tipo RE7, es decir un cebador que consiste de la secuencia de ácido.

Métodos de detección de S. aureus resistente a meticilina, así como cebadores, sondas y kits para los mismos

La presente invención se refiere a métodos de detección de la presencia o ausencia de S. aureus resistente a meticilina (MRSA) en una muestra, comprendiendo el método la realización de una etapa de amplificación, una etapa de hibridación y una etapa de detección. Además, la presente invención se refiere a cebadores, sondas y kits para la detección de MRSA.

Staphylococcus aureus (S. aureus, SA) es una bacteria cuyo reservorio natural son áreas mucosas o de piel húmeda/salada tales como ingles, ano o nariz. Además, habita en heridas. Globalmente, la nariz es el ambiente principal de S. aureus. Sin embargo, S. aureus puede provocar enfermedades que van desde infecciones menores de la piel (tales como máculas, forúnculos y celulitis) y abscesos, hasta enfermedades graves tales como neumonía, meningitis, endocarditis, síndrome del choque térmico (SCT) , septicemia y síndrome de la disfunción multiorgánica (SDMO) . Cada año, unos 500.000 pacientes en los hospitales estadounidenses contraen una infección estafilocócica.

Actualmente S. aureus ha adquirido resistencia a muchos antibióticos de uso general. En el Reino Unido, sólo 2% de todos los aislados de S. aureus son sensibles a la penicilina, y la situación es similar en el resto del mundo. Las penicilinas resistentes a º-lactamasa (meticilina, oxacilina, cloxacilina flucloxacilina) han sido desarrolladas para tratar S. aureus resistente a penicilina y todavía se utilizan como tratamiento de primera línea. La meticilina fue el primer antibiótico de esta clase en ser utilizado (se introdujo en 1959) , aunque sólo dos años después se informó del primer caso de S. aureus resistente a meticilina (SARM) en Inglaterra. SARM también se conoce como Staphylococcus aureus resistente a oxacilina (SARO) y Staphylococcus aureus de múltiple resistencia, mientras que las cepas no resistentes a meticilina de S. aureus en ocasiones se denominan Staphylococcus aureus sensible a la meticilina (SASM) en el caso de que resulte necesario realizar una distinción explícita.

A pesar de su resistencia, SARM seguía siendo una observación infrecuente incluso en el contexto hospitalario hasta los años '90, cuando la prevalencia de SARM se incrementó drásticamente en los hospitales, en donde ahora es endémica. Además, en los EEUU crecientemente se informan casos de brotes de colonización e infección por SARM por medio del contacto con la piel en vestuarios y gimnasios, incluso en poblaciones sanas. SARM también se está convirtiendo en un problema pediátrico (Johnson A.P. et al., J. Antimicrob. Chemother. 56 (3) : 455-62) . Desde principios de 2005 el número de muertes en el Reino Unido atribuidas a SARM ha sido estimado por diversas fuentes en aproximadamente 3.000 al año (Johnson, supra) .

Las infecciones causadas por SARM muestran una tasa de letalidad más alta y síntomas más severos, ya que el tratamiento se encuentra restringido debido a las resistencias a unos pocos antibióticos. El tratamiento de primera línea para SARM actualmente son los antibióticos glucopéptidos (vancomicina y teicoplanina) . Sin embargo, estos antibióticos presentan varios problemas, principalmente centrados en la necesidad de la administración intravenosa (no se dispone de preparación oral) , la toxicidad y la necesidad de realizar un seguimiento de los niveles de fármaco regularmente mediante análisis de sangre. También es problemático que los antibióticos glucopéptidos no penetran muy bien en los tejidos infectados (éste es un problema particular con las infecciones del cerebro y las meninges y en la endocarditis) . Sin embargo, los glucopéptidos no deben utilizarse para tratar S. aureus sensible a meticilina, ya que los resultados son peores. Conjuntamente, los pacientes infectados por SARM presentan estancias hospitalarias más prolongadas que los pacientes infectados meramente por SA.

Además, la colonización no identificada con SARM puede conducir al contagio de SARM de un paciente a otro mediante la sustitución con SARM de la flora de los pacientes no colonizados por SARM. La colonización resulta facilitada por determinados factores de riesgo, entre ellos, por ejemplo, el tratamiento antibiótico previo, la polimorbilidad y la diabetes, así como estancias hospitalarias anteriores.

A partir de lo anterior resulta altamente importante disponer de una herramienta segura y fiable para el diagnóstico y/o detección de SARM.

En la actualidad, el diagnóstico de la mayoría de infecciones de la piel se realiza a partir del patrón de síntomas y los resultados del examen físico, pero habitualmente no resulta posible saber si la infección está causada por bacterias Staphylococcus de un tipo particular o por otra bacteria, tal como, por ejemplo, Streptococcus º-hemolítico del grupo A (Streptococcus pyogenes) . Para realizar un diagnóstico definitivo y para confirmar que SARM es la bacteria causante de la infección, puede llevarse a cabo un cultivo. Sin embargo, el diagnóstico de SARM mediante cultivo convencional requiere 16 a 72 horas, provocando un retraso en el tratamiento, perjudicando significativamente los resultados clínicos y potencialmente facilitando la incidencia de brotes, así como el incremento de los costes hospitalarios.

Los análisis fenotípicos, tales como de tipo coagulasa, de tipo enterotoxina (SE) , producción de toxina 1 del síndrome del choque tóxico y susceptibilidad in vitro a antibióticos, han sido utilizados rutinariamente para el tipado de cepas de SARM.

Además, se ha establecido el análisis genotípico para las cepas de SARM, proporcionando una clasificación más detallada que los análisis fenotípicos. En particular, la electroforesis en gel de campo pulsado (EGCP) con fragmentos de restricción de ADN genómico total de SARM es un método excelente de caracterización.

Alternativamente, se ha utilizado la tipificación de secuencias multilococus (TSML) para caracterizar aislados de bacterias mediante la utilización de secuencias de fragmentos internos de siete genes de mantenimiento. Se ha desarrollado y validado la TSML para S. aureus (Enright et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 7687-7692, 2002) y proporciona un método discriminatorio que permite identificar con facilidad cepas relacionadas que se han recuperado en países diferentes.

La patente EP nº 1529847 da a conocer un método para detectar SARM utilizando cebadores específicos para la unión situada a la derecha respecto a SSC mec.

Se han desarrollado kits de ensayo para detectar SARM (por ejemplo el ensayo IDI-MRSA, Becton Dickinson, USA) , el cual es un ensayo diagnóstico in vitro para la detección directa de la colonización nasal por parte de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) para ayudar a prevenir y controlar las infecciones por SARM en el ámbito clínico.

Sin embargo, dicho kit presenta una serie de desventajas que limitan su utilidad. En primer lugar, no detecta el SARM del casete cromosómico estafilocócico (SCC) de tipo V, el cual resulta importante ya que SCC tipo V es un tipo identificado con anterioridad, especialmente presente en Asia y Australia. En segundo lugar, su aplicabilidad es limitada si el número de sondas es elevado. En tercer lugar, la preparación de las muestras es bastante complicada o resulta difícil. En cuarto lugar, el concepto utilizado para los controles no es del estado de la técnica. Además, la tasa de inhibición es bastante elevada y, finalmente, se requiere un número elevado de cebadores y sondas, resultando en una herramienta diagnóstica con tendencia a los errores. Además, el análisis de curvas de fusión que puede utilizarse en el ensayo de sondas FRET permite una especificidad más alta dentro de la señal de salida que con las curvas de amplificación. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un método alternativo para detectar el SARM, preferentemente un método alternativo que evita las desventajas anteriormente indicadas.

El objetivo de la presente invención se ha resuelto proporcionando un método para detectar la presencia o ausencia de S. aureus resistente a la meticilina (SARM) en una muestra, comprendiendo el método:

(a) la realización de una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con un conjunto de cebadores de SARM con el fin de producir un producto de amplificación en el caso de que SARM se encuentre presente en la muestra,

(b) la realización de una etapa de hibridación que comprende poner en contacto el producto de amplificación de la etapa (a) con una pareja de sondas de SARM, en la que una primera sonda de SARM de la pareja de sondas... [Seguir leyendo]

1. Método de detección de la presencia o ausencia de S. aureus resistente a meticilina (SARM) en una muestra, comprendiendo el método:

(a) la realización de una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con un conjunto de cebadores de SARM con el fin de producir un producto amplificación en el caso de que SARM se encuentre presente en la muestra,

(b) la realización de una etapa de hibridación que comprende poner en contacto el producto de amplificación de la etapa (a) con una pareja de sondas de SARM, en la que una primera sonda de SARM se marca con una pareja de sondas de SARM con una fracción fluorescente donadora y en la que una segunda sonda de SARM de la pareja de sondas de SARM se marca con una fracción fluorescente aceptora correspondiente, y

(c) la detección de la presencia o ausencia de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) entre la fracción fluorescente donante de la primera sonda de SARM y la fracción fluorescente aceptora de la segunda sonda de SARM, en la que la presencia de FRET es indicativa de la presencia de SARM en la muestra, y en la que la ausencia de FRET es indicativa de la ausencia de SARM en la muestra, en el que el método es capaz de detectar cada uno de los casetes cromosómicos estafilocócicos (SCCmec) de tipos I a V del SARM, y en el que el conjunto de cebadores comprende:

(i) un cebador específico para SARM tipo RE2, es decir, un cebador que consiste de la secuencia de ácidos nucleico.

5. TGA AAT GAA AGA CTG CGG AG -3’ (SARM directo RE2 sentido; SEC ID nº 92) ; y

(ii) un cebador específico para SARM tipo RE3, es decir un cebador que consiste de la secuencia de ácidos nucleicos 5’-CCA CAT CTC ATT AAA TTT TTA AAT TAT ACA C -3’ (SARM directo RE3 sentido; SEC ID nº 93) ; y

(iii) un cebador específico para SARM tipo RE7, es decir un cebador que consiste de la secuencia de ácidos nucleicos 5’-CAA TCC TTT TTA TAT TTA AAA TAT ATT ATA CAC -3’ (SARM directo RE7 sentido; SEC ID nº 94) .

2. Método según la reivindicación 1, en el que el conjunto de cebadores comprende además un cebador adicional específico para S. aureus resistente a la meticilina (SARM) , así como S. aureus sensible a la meticilina (SASM) .

3. Método según la reivindicación 2, en el que el cebador adicional comprende o consiste de la secuencia de ácidos nucleicos 5’-CAA GGA AAG ATG CTA TCT TCC G -3’ (SARM directo inv.; SEC ID nº 95) .

4. Método según la reivindicación 1 ó 3,

- en el que el conjunto de cebadores consiste de, como máximo, 4 ó 5 cebadores, y/o

- en el que el conjunto de cebadores comprende o consiste de SARM directo RE2 sentido, SARM directo RE3 sentido y SARM directo RE7 sentido y un cebador inverso.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el cebador inverso es SARM directo inv.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que por lo menos una sonda de la pareja de sondas comprende o consiste de una fracción fluorescente y una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada de entre el grupo que consiste de:

- 5’-AAG TCG CTT TGC CCT TGG G -3’ (SARM directo Fluos sin marcaje; SEC ID nº 96) , y

- 5’-CAT GCG TTG GTT CGA TTC TTG -3’ (SARM directo Red 610 sin marcaje; SEC ID nº 97) .

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la primera sonda, que incluye el primer marcaje, es 5’-AAG TCG CTT TGC CCT TGG G -3’-fluoresceína (SARM directo Fluos) , y en el que la segunda sonda, que incluye el segundo marcaje, es LC-Re.

61. 5'-CAT GCG TTG GTT CGA TTC TTG -3' (SARM Red 610 directo) .

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,

- en el que los elementos de la pareja de sondas de SARM se hibridan con el producto de amplificación separados por

no más de cinco, cuatro o tres nucleótidos. y/o

- en la que:

(a) la fracción fluorescente donadora es fluoresceína, y/o

(b) en la que la fracción fluorescente aceptora se selecciona de entre el grupo que consiste de LC-Red 610, LC-Red 640, LC-Red 670, LC-Red 705, Cy5 y Cy5.5

9.Método de detección de la presencia o ausencia de S. aureus resistente a meticilina (SARM) en una muestra, comprendiendo el método:

(a) la realización de una etapa de amplificación que comprende poner en contacto la muestra con un conjunto de cebadores de SARM con el fin de producir un producto amplificación en el caso de que SARM se encuentre presente en la muestra,

(b) la realización de una etapa de hibridación que comprende poner en contacto el producto de amplificación de la etapa (a) con una sonda de SARM, en la que la sonda de SARM se marca con una fracción fluorescente donadora y con una fracción fluorescente aceptora correspondiente, y

(c) la detección de la presencia o ausencia de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) entre la fracción fluorescente donadora y la fracción fluorescente aceptora de la sonda de SARM, en la que la presencia o ausencia de FRET es indicativa de la presencia o ausencia de SARM en la muestra, en el que el método es capaz de detectar cada uno de los casetes cromosómicos estafilocócicos (SSCmec) tipos I a V del SARM, y en el que el conjunto de cebadores es tal como se define en las reivindicaciones 1 a 6.

10. Método según la reivindicación 9,

a) en el que la sonda comprende o consiste de dos fracciones fluorescentes, b) en el que la sonda comprende o consiste de dos fracciones fluorescentes, en la que la fracción fluorescente donadora es la fluoresceína, y/o en la que la fracción fluorescente aceptora se selecciona de entre el grupo que consiste de LC-Red 610, LC-Red 640, LC-Red 670, LC-Red 705, Cy5 y Cy5.5, c) en el que la etapa de amplificación utiliza un enzima polimeras que presenta actividad de exonucleasa 5' a 3', d) en el que las fracciones fluorescentes donadora y aceptora se encuentran separadas por no más de 5 nucleótidos en la sonda, e) en el que la sonda comprende una secuencia de ácidos nucleicos que permite la formación de estructura secundaria, en la que la formación de estructura secundaria resulta en la proximidad espacial de las fracciones fluorescentes donadora y aceptora, y/o f) en el que la fracción fluorescente aceptora es un extintor.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10,

a) en el que la etapa de detección comprende excitar la muestra a una longitud de onda absorbida por la fracción fluorescente donadora y visualizar y/o medir la longitud de onda emitida por la fracción fluorescente aceptora, b) en el que la detección comprende cuantificar la FRET, c) en el que la presencia de FRET en 55, 45 ó 35 ciclos es indicativa de la presencia de SARM en la muestra, d) en el que la etapa de detección se lleva a cabo tras cada etapa de amplificación e hibridación y/o en tiempo real, e) que comprende además determinar la temperatura de fusión entre una o ambas sondas y el producto de amplificación de la etapa (a) , en la que la temperatura de fusión confirma la presencia o la ausencia de SARM, f) que comprende además:

prevenir la amplificación de un ácido nucleico contaminante,

g) que comprende además:

prevenir la amplificación de un ácido nucleico contaminante mediante la realización de la etapa de amplificación (a) en presencia de uracilo y tratar la muestra con uracil-ADN-glucosilasa previamente a una primera etapa de amplificación,

h) en el que el método se lleva a cabo en una muestra de control, i) en el que la muestra es una muestra biológica, y/o j) en el que la muestra se selecciona de entre el grupo que consiste de un hisopo de una herida infectada, un hisopo de piel, un hisopo nasal, un hisopo de garganta, un hisopo de ingle, un hisopo de axila, un hisopo del sitio de un dispositivo invasivo, un hisopo del sitio de posible infección, un líquido corporal, una muestra de sangre, una muestra de orina y un hisopo de perineo.

12. Composición que comprende un conjunto de cebadores según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

13. Composición según la reivindicación 12, que comprende además una sonda y/o una pareja de sondas según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 ó 12.

14. Kit que comprende:

(a) un conjunto de cebadores según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,

(b) una pareja de sondas según la reivindicación 6 ó 8 ó una sonda según la reivindicación 10, y (c) una fracción fluorescente donadora y una fracción fluorescente correspondiente de marcaje de la sonda o sondas, en el que el kit es capaz de detectar cada uno de los casetes cromosómicos estafilocócicos (SCCmec) de tipos I a V de SARM.

15. Kit según la reivindicación 14, a) que resulta adecuado para llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, b) que comprende además una etiqueta en el paquete o material impreso en el mismo con instrucciones de utilización del conjunto de cebadores de SARM y de la pareja de sondas de SARM para detectar la presencia o ausencia del mismo en una muestra, y/o c) que comprende además uracil-ADN-glucosilasa y/o una ADN polimerasa y/o un tampón adecuado.