Método para preparar ácidos grasos poliinsaturados en plantas transgénicas.

Proceso para producir compuestos de la fórmula general I **Fórmula**

en semillas de plantas transgénicas con un contenido de al menos 20 % en peso respecto del contenido total delípido,

que comprende los siguientes pasos de proceso:

a) Introducir al menos una secuencia de ácido nucleico al organismo, la cual codifica una actividad de Δ-9-elongasao una actividad de Δ-6-desaturasa, y

b) Introducir al menos una secuencia de ácido nucleico al organismo, la cual codifica una actividad de Δ-8-desaturasa o una actividad de Δ-6-elongasa, y

c) Introducir al menos una secuencia de ácido nucleico al organismo, la cual codifica una actividad de Δ-5-desaturasa, y

d) Introducir al menos una secuencia de ácido nucleico al organismo, la cual codifica una actividad de Δ-5-elongasa,y

e) Introducir al menos una secuencia de ácido nucleico al organismo, la cual codifica una actividad de Δ-4-desaturasa, y

en cuyo caso las variables y sustituyentes en la fórmula I tienen el siguiente significado:

R1 ≥ hidroxilo, coenzima A-(tioéster), un residuo de liso-fosfatidilcolina, liso-fosfatidiletanolamina, lisofosfatidilglicerol,liso-difosfatidilglicerol, liso-fosfatidilserina, liso-fosfatidilinositol, esfingo-base, o un residuo de lafórmula general II **Fórmula**

Metodo para preparar acidos grasos poliinsaturados en plantas transgenicas

La presente invencion se refiere a un metodo para producir acidos grasos poliinsaturados en semillas de plantas transgenicas introduciendo acidos nucleicos en el organismo los cuales codifican polipeptidos con actividad de w-35 desaturasa, L-12-desaturasa, L-6-desaturasa, L-6-elongasa, L-5-desaturasa, L-5-elongasa y/o L-4-desaturasa, preferiblemente polipeptidos con actividad de L-6-desaturasa, L-6-elongasa y L-5-desaturasa.

Las secuencias de acidos nucleicos son las secuencias representadas en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199 y SEQ ID NO: 201. Ademas de estas secuencias de acidos nucleicos, se prefiere introducir a la planta y tambien expresar simultaneamente otra secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido con una actividad de L-12-desaturasa. De modo particularmente preferido esta es la secuencia de acido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 195.

Estas secuencias de acido nucleico tambien pueden expresarse de manera ventajosa en el organismo opcionalmente junto con otras secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos de la biosintesis del metabolismo de acido graso o de lipido. Particularmente son ventajosas secuencias de acido nucleico que codifican una actividad de L-6-desaturasa, de L-5-desaturasa, L-4-desaturasa, L-12-desaturasa y/o de L-6-elongasa. Estas desaturasas y elongasas provienen ventajosamente de Thalassiosira, Euglena u Ostreococcus. Ademas, la invencion se refiere a un metodo para la produccion de aceites y/o triacilgliceridos con un contenido elevado de acidos grasos poli-insaturados de cadena larga.

La invencion se refiere, en una modalidad preferida, ademas a un metodo para producir acido araquidonico, acido eicosapentaenoico o acido docosahexaenoico y a un metodo para la produccion de trigliceridos con un contenido elevado de acidos grasos insaturados, en particular acido araquidonico, acido eicosapentaenoico y/o acido docosahexaenoico en plantas transgenicas, ventajosamente en semillas de las plantas transgenicas. La invencion se refiere a la produccion de una planta transgenica con contenido elevado de acidos grasos poliinsaturados, principalmente acido araquidonico, acido eicosapentaenoico y/o acido docosahexaenoico, debido a la expresion de las elongasas y desaturasas usadas en el metodo de la invencion.

Invencion se refiere ademas a moleculas de acido nucleico recombinantes que contienen las secuencias de acido nucleico que codifican los polipeptidos con actividad de L-6-desaturasa, L-6-elongasa, L-5-desaturasa y L-5elongasa, de manera conjunta o individual, asi como plantas transgenicas que contienen las moleculas de acido nucleico.

Una parte mas de la invencion se refiere a aceites, lipidos y/o acidos grasos preparados segun el metodo de la invencion y a su uso. Ademas la invencion se refiere acidos grasos insaturados asi como trigliceridos con un alto contenido de acidos grasos insaturados y a su uso.

La sintesis de lipidos pueden dividirse en dos secciones: la sintesis de acidos grasos y su enlazamiento a snglicerina-3-fosfato asi como la adicion o modificacion de un grupo de cabeza polar. Los lipidos habituales que se 35 usan en las membranas comprenden fosfolipidos, glicolipidos, esfingolipidos y fosfogliceridos. La sintesis de acidos grasos inicia con la conversion de acetil-CoA en malonil-CoA mediante la acetil-CoA-carboxilasa o en acetil-ACP mediante la acetiltransacilasa. Despues de una reaccion de condensacion, estas dos moleculas de producto forman conjuntamente acetoacetil-ACP, el cual se convierte por medio de una serie de reacciones de condensacion, reduccion y deshidrogenacion de tal modo que se obtiene una molecula de acido graso saturado con una longitud de 40 cadena deseada. La produccion de los acidos grasos insaturados a partir de estas moleculas se cataliza mediante desaturasas especificas, o bien aerobicamente por medio de oxigeno molecular, o bien anaerobica mente (respecto de la sintesis de acido graso en microorganismo, vease F.C. Neidhardt et al. (1996) E. coli y Salmonella. ASM Press: Washington, D.C., S. 612-636 y las referencias bibliograficas alli contenidas, Lengeler et al. (editor) (1999) Biology of Procar y otes. Thieme: Stuttgart, New York, y las referencias bibliograficas alli contenidas, asi como Magnuson, K., et 45 al. (1993) Microbiological Reviews 57:522-542 y las referencias bibliograficas alli contenidas) . Para alargarse mas, los acidos grasos enlazados a fosfolipidos que se obtienen de esta manera tienen que transferirse desde los fosfolipidos de vuelta a la combinacion de acido graso CoA-ester. Esto se hace posible gracias a acilCoA:lisofosfolipido-aciltransferasas. Ademas, estas enzimas pueden transferir los acidos grasos alongados desde los CoA-esteres de vuelta a los fosfolipidos. Esta secuencia de reaccion puede hacerse opcionalmente muchas 50 veces.

Ademas, los acidos grasos tienen que transportarse a continuacion a diversos sitios de modificacion e incorporarse al lipido de almacenamiento de triacilglicerina. Otro paso importante en la sintesis de lipido es la transferencia de acidos grasos a los grupos de cabeza polares, por ejemplo mediante glicerina-acido graso-aciltransferasa (vease Frentzen, 1998, Lipid, 100 (4-5) :161-166) .

veanse publicaciones acerca de la sintesis de acido graso vegetal, de saturacion, el metabolismo y el transporte de membrana de compuestos lipidicos, beta-oxidacion, la modificacion de acidos grasos y co-factores y el almacenamiento y ensamblaje de triacilglicerina, incluidas las citas bibliograficas de las mismas, en los siguientes articulos: Kinney, 1997, Genetic Engineering, editor: JK Setlow, 19:149-166; Ohlrogge y Browse, 1995, Plant Cell 7:957-970; Shanklin y Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611-641; Voelker, 1996, Genetic Engeneering, editor: JK Setlow, 18:111-13; Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R. 31:397-417; Guhnemann-Schafer & Kindl, 1995, Biochim. Biophys Acta 1256:181-186; Kunau et al., 1995, Prog. Lipid Res. 34:267-342; Stymne et al., 1993, en: Biochemistr y and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, Editor: Murata y Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal. 13 (1) :1-16.

En lo sucesivo, los acidos grasos poliinsaturados se denominan como PUFA, PUFAs, LCPUFA o LCPUFAs (poly unsaturated fatty acids, PUFA, acidos grasos poliinsaturados; long chain poly unsaturated fatty acids, LCPUFA, acidos grasos poliinsaturados de cadena larga) .

Los acidos grasos y triacilgliceridos tienen una gran cantidad de aplicaciones en la industria alimenticia, la alimentacion de animales, la cosmetologia y el campo farmaceutico. Dependiendo de si son acidos saturados oben saturados libres o de si son triacilgliceridos con un contenido elevado de acidos saturados poliinsaturados, son adecuados para aplicaciones muy diferentes. Los acidos grasos poliinsaturados tales como el acido linoleico y el acido linolenico son esenciales para los mamiferos puesto que no pueden producirse por estos ultimos. Es por eso que los acidos grasos poliinsaturados w-3 y w-6 representan un componente importante de la alimentacion animal y humana. De esta manera, por ejemplo, en la nutricion humana se prefieren lipidos con acidos grasos insaturados, especificamente con acidos grasos poliinsaturados. A los acidos grasos poliinsaturados w-3 se les atribuye en tal caso un efecto positivo en el nivel de colesterol en la sangre y, de esta manera, en la prevencion de enfermedad cardiaca. Adicionando estos acidos grasos w-3 a la alimentacion, se reduce ostensiblemente el riesgo de una enfermedad cardiaca, una apoplejia o de hipertension (Shimikawa 2001, World Rev. Nutr. Diet. 88, 100-108) .

Incluso los procesos inflamatorios, especialmente los procesos inflamatorios cronicos, en el marco de enfermedades inmunologicas tales como la artritis reumatoide se ven afectados positivamente por los acidos grasos w-3 (Calder 2002, Proc. Nutr. Soc. 61, 345-358; Cleland y James 2000, J. Rheumatol. 27, 2305-2307) . Por esto, se adicionan a los productos alimenticios, especialmente a productos alimenticios dieteticos, o se emplean en medicamentos. Los acidos grasos w-6 tales como el acido araquidonico tienden a tener un efecto negativo en conexion con estas enfermedades reumatologicas.

Los acidos grasos w-3 y w-6 son precursores de hormonas del tejido, conocidas como eicosanoides, tales como las prostaglandinas las cuales se derivan del acido dihomo-y-linolenico, acido araquidonico y del acido eicosapentaenoico, y de los tromboxanos y leucotrienos, los cuales se derivan del acido araquidonico y del acido eicosapentaenoico. Los eicosanoides (llamados serie PG2) , que se forman a partir de acidos grasos w-6, generalmente... [Seguir leyendo]

1.º Proceso para producir compuestos de la formula general I

en semillas de plantas transgenicas con un contenido de al menos 20 % en peso respecto del contenido total de lipido, que comprende los siguientes pasos de proceso:

a) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico al organismo, la cual codifica una actividad de L-9-elongasa o una actividad de L-6-desaturasa, y

b) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico al organismo, la cual codifica una actividad de L-8desaturasa o una actividad de L-6-elongasa, y

c) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico al organismo, la cual codifica una actividad de L-5desaturasa, y

d) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico al organismo, la cual codifica una actividad de L-5-elongasa, y

e) Introducir al menos una secuencia de acido nucleico al organismo, la cual codifica una actividad de L-4desaturasa, y

en cuyo caso las variables y sustituyentes en la formula I tienen el siguiente significado:

R1 = hidroxilo, coenzima A- (tioester) , un residuo de liso-fosfatidilcolina, liso-fosfatidiletanolamina, lisofosfatidilglicerol, liso-difosfatidilglicerol, liso-fosfatidilserina, liso-fosfatidilinositol, esfingo-base, o un residuo de la formula general II

R2 = hidrogeno, liso-fosfatidilcolina, liso-fosfatidiletanolamina, liso-fosfatidilglicerol, liso-difosfatidilglicerol, lisofosfatidilserina, liso-fosfatidilinositol o alquilcarbonilo de C2-C24, saturado o insaturado,

R3 = hidrogeno, alquilcarbonilo de C2-C24, saturado o insaturado, -o R2 o R3 independientemente entre si significan un residuo de la formula general Ia:

n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 9, m = 2, 3, 4, 5 o 6 y p = 0 o 3.

2.º Proceso de acuerdo con la reivindicacion 1, en cuyo caso las variables n, m y p tienen el siguiente significado:

n = 2, 3 o 5, m = 4, 5 o 6 y p = 0 o 3.

3.º Proceso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, caracoerizadoº porºueº en la formulaI m = 4, n = 3, p = 3 y el compuesto es acido araquidonico y/o m = 5, n = 3, p = 0 y el compuesto es acido eicosapentaenoico y/o m = 5, n = 5, p = 0 y el compuesto es acido docosapentaenoico y/o m = 6, n = 3, p = 0 y el compuesto es acido docosahexaenoico.

4.º Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 2 a 3, caracoerizado porºue en las semillas de plantas transgenicas el contenido de todos los compuestos de la formula I tomados juntos es de al menos 27 % en peso respecto del contenido total de lipidos.

5.º Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 2 a 3, caracoerizado porºue en las semillas de plantas transgenicas el contenido de acido docosahexaenoico es de al menos 1 % en peso respecto del contenido total de lipidos.

6.º Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, caracoerizadoº porºueº la secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos con actividad de L-9-elongasa, L-6-desaturasa, L-8-desaturasa, L-6-elongasa, L-5desaturasa, L-5-elongasa o L-4-desaturasa, se seleccionan del grupo constituido por:

a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199 o SEQ ID NO: 201, o b) Secuencias de acido nucleico que pueden derivarse como resultado del codigo genetico degenerado de las secuencias de aminoacidos representadas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200 o SEQ ID NO: 202, o c) Secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos con al menos 40 % de identidad a nivel de aminoacido con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200 o SEQ ID NO: 202 y presentan una actividad de L-9-elongasa, L-6-desaturasa, L-8-desaturasa, L-6-elongasa, L-5desaturasa, L-5-elongasa o L-4-desaturasa.

7.º Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, caracoerizadoºporºueº adicionalmente se introduce a la planta transgenica una secuencia de acido nucleico que codifica polipeptidos con actividad w3-desaturasa, seleccionada del grupo constituido por:

a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en SEQ ID NO: 87 o SEQ ID NO: 105, o b) secuencias de acido nucleico que pueden derivarse como resultado del codigo genetico degenerado de la secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NO: 88 o SEQ ID NO: 106, o c) Secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos con al menos 60 % de identidad a nivel de aminoacidos con SEQ ID NO: 88 o SEQ ID NO: 106 y tienen una actividad de w3-desaturasa.

8.º Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, caracoerizadoº porºueº adicionalmente a la planta transgenica se introduce una secuencia de acido nucleico que codifica polipeptidos con actividad de L-12-desaturasa, seleccionada del grupo constituido por:

a) una secuencia de acido nucleico con la secuencia representada en SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109 o SEQ ID NO: 195, o b) secuencias de acido nucleico que pueden derivarse como resultado del codigo genetico degenerado de la secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110 o SEQ ID NO: 196, o c) secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos con actividad de al menos 60 % de identidad a nivel de aminoacidos con SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110 o SEQ ID NO: 196 y tienen una actividad de L-12-desaturasa.

9.º Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, caracoerizadoº porºueº adicionalmente, a la planta transgenica se introduce una secuencia de acido nucleico la cual codifica proteinas de la ruta de biosintesis del metabolismo de acido graso o de lipido, seleccionada del grupo de acil-CoA-dehidrogenasa (s) , acil-ACP[= acil carrier protein]desaturasa (s) , acil-ACP-tioesterasa (s) , acido graso-acil-transferasa (s) , acil-CoA:lisofosfolipido-aciltransferasa (s) , acido graso-sintasa (s) , acido graso-hidroxilasa (s) , acetil-coenzima A-carboxilasa (s) , acil-coenzima A-oxidasa (s) , acido graso-desaturasa (s) , acido graso-acetilenasas, lipoxigenasas, triacilglicerol-lipasas, allenoxido-sintasas, hidroperoxido-liasas o acido graso-elongasa (s) .

10.º Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9, caracoerizadoº porºueº los sustituyentes R2 o R3 significan independientemente entre si alquilcarbonilo de C18-C22 saturado o insaturado.

11.º Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, caracoerizadoº porºueº los sustituyentes R2 o R3 significan independientemente entre si alquilcarbonilo de C18, C20 o C22 con al menos dos enlaces dobles.

12.º Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 11, caracoerizadoº porºueº la planta transgenica se selecciona del grupo de una planta productora de aceite, una planta hortaliza o una planta ornamental.

13.º Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 12, caracoerizadoº porºueº el organismo transgenico es una planta transgenica seleccionada del grupo de las familia de vegetales: Anacardiaceae, Asteraceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Cannabaceae, Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Elaeagnaceae, Euforbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Leguminosae, Linaceae, Malvaceae, Moringaceae, Marchantiaceae, Onagraceae, Olacaceae, Oleaceae, Papaveraceae, Piperaceae, Pedaliaceae, Poaceae o Solanaceae.

14.º Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13, caracoerizadoº porºueº los compuestos de la formula general I se aislan del organismo en forma de sus aceites, lipidos o acidos grasos libres.

15.º Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 12 a 14, en cuyo caso todas las secuencias de acido nucleico se introducen a las plantas a una molecula de acido nucleico recombinante compartida.

16.º Proceso segun la reivindicacion 15, en cuyo caso cada secuencia de acido nucleico se encuentra bajo control de un promotor propio.

17.º Proceso segun la reivindicacion 16, en cuyo caso el promotor propio es un promotor especifico de semillas.

18.º Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 15 a 17, en cuyo caso en la formula I m = 4, n = 3, p = 3 y el compuesto es acido araquidonico y/o m = 5, n = 3, p = 0 y el compuesto es acido eicosapentaenoico y/o m = 6, n = 3, p = 0 y el compuesto es acido docosahexaenoico.

19.º Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 15 a 18, en cuyo caso la planta es una planta de semillas oleaginosas o de frutos oleaginosos.

20.º Proceso segun la reivindicacion 19, en cuyo caso la planta se selecciona del grupo compuesto por soja, cacahuete, colza, canola, lino, onagra, verbasco, cardo, avellana, almendra, macadamia, aguacate, laurel, rosas silvestres, calabaza/calabacin, pistachos, ajonjoli, girasol, cardamo, borraja, maiz, amapola, mostaza, canamo, ricino, olivo, calendula, punica, palma de aceite, nuez de nogal y coco.

21.º Proceso segun la reivindicacion 19 o 20, en cuyo caso la planta es Brassica juncea.

22.º Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 15 a 21, en cuyo caso los compuestos de la formula I se obtienen de la planta en forma de sus aceites, lipidos y acidos grasos libres.

23.º Proceso segun la reivindicacion 22, en cuyo caso de los compuestos de la formula I se liberan acidos grasos insaturados o saturados.

24.º Proceso segun la reivindicacion 23, en cuyo caso la liberacion se efectua mediante hidrolisis alcalina o disociacion enzimatica.

25.º Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 15 a 24, en cuyo caso la concentracion de acido araquidonico es de al menos 25%, respecto de todo el contenido de lipidos de las plantas transgenicas.

26.º Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 15 a 24, en cuyo caso la concentracion de acido eicosapentaenoico es de al menos 15%, respecto de todo el contenido de lipidos de las plantas transgenicas.

27.º Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 15 a 26, caracoerizadoº porºueº los compuestos de la formula general I se aislan del organismo en forma de sus aceites, lipidos o acidos grasos libres.

28.º Plantas transgenicas que contienen

a) una delta-6 desaturasa que comprende una secuencia de aminoacidos segun SEQ ID NO 202 o con al menos 40% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos segun SEQ ID NO 202, b) una delta-6 elongasa, c) una delta-5 desaturasa, d) una delta-5 elongasa y

e) una delta-4 desaturasa, en cuyo caso las plantas, en sus semillas, pueden producir compuestos de la formula general I segun la reivindicacion 1, con un contenido de al menos 20 % en peso respecto contenido total de lipidos.

29.º Plantas transgenicas que contienen a) una delta-9 elongasa b) una delta-8 desaturasa.

Figura 5: Composicion de acidos grasos (en % molar) de levaduras transgenicas que habian sido transformados con vectores pYes3-OmELO3/pYes2-EgD4 o pYes3-OmELO3/pYes2-EgD4+pESCLeu-PtD5. Las celulas de levadura se cultivaron en medio minimo sin triptofano ni uracilo / ni leucina en presencia de 250 μM 20:5Δ5, 8, 11, 14, 17 o 18:4Δ6, 9, 12, 15 . Los esteres de metilo de acido graso se obtuvieron por metanolisis acida de los sedimentos celulares y se analizaron mediante GLC. Cada valor representa el valor medio (n=4) ± desviacion estandar.

Figura 12: Desaturacion de acido linoleico (acido graso 18:2 ω-6) en acido α-linolenico (acido graso 18:3 ω-3) por medio de Pi-omega3Des Figura 13: Desaturacion de acido g-linolenico (acido graso 18:3 ω-6) en acido estearidonico (acido graso 18:4 ω-3) mediante Pi-omega3Des Figura 14: Desaturacion de acido graso C20:2 ω-6 en acido graso C20:3 ω-3 mediante Pi-omega3Des Figura 16: Desaturacion de acido araquidonico (acido graso C20:4-w-6) en acido eicosapentaenoico (acido graso C20:5-ω-3) mediante Pi-omega3Des Figura 17: Desaturacion de acido docosatetraenoico (acido graso C22:4-ω-6) en acido docosapentaenoico (C22:5-ω3) mediante Pi-omega3Des

% DE DESATURACIIN

Figura 19: Desaturacion de acido araquidonico enlazado a fosfolipido hasta EPA mediante Pi-Omega3Des Figura 20: Conversion de acido linoleico (flecha) en acido γ-linolenico (γ-18:3) mediante Ot-Des6.1. ABSORCIIN mAU

Tiempo de retencion Figura 21: Conversion de acido linoleico y acido a-linolenico (A y C) , asi como reconstitucion de la ruta de sintesis de ARA y EPA en levadura (B y D) en presencia de OtD6.1.

Figura 24: Elongacion de acido eicosapentaenoico mediante OtElo1 (B) y OtElo1.2 (D) . Los controles (A, C) no muestran el producto de la elongacion (22:5ω3)

Figura 25: Elongacion de acido araquidonico mediante OtElo1 (B) y OtElo1.2 (D) . Los controles (A, C) no muestran el producto de la elongacion (22:4ω6)

Tiempo de retencion en min Figura 27: Especificidad de sustrato de la Xenopus elongasa (A) , Clona elongasa (B) y Oncorhynchus elongasa (C)

Acido graso Figura 28: Especificidad de sustrato de la Ostreococcus Δ-5-elongasa (A) , de la Ostreococcus Δ-6-elongasa (B) , de la Thalassiosira Δ-5-elongasa (C) y Thalassiosira treococcus Δ-6-elongasa (D)

Figura 29: Expresion de la Phaeodactylum tricomutum D-6-elongasa (PtELO6) en levadura. A) muestra la elongacion del acido graso C18:3Δ6, 9, 12 y B) la elongacion del acido graso C18:4Δ6, 9, 12, 15

Figura 30: la figura 30 muestra la especificidad de sustrato de PtELO6 respecto de los sustratos alimentados Figura 33: DHA en semillas transgenicas de Brassica juncea. Las plantas se transformaron con el constructo pSUN8G.