Método para incrementar la funcionalidad de un vector de AAV.

Un vector de virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside AAVhu48 seleccionada en el grupo consistenteen:

(a) cápside de hu48 que tiene la secuencia SEQ ID Núm. 50 modificada para que contenga una serina en laposición 277 de residuo de aminoácido, que es de forma nativa una glicina, y para que contenga una lisina en laposición 322 de residuo de aminoácido, que es de forma nativa un ácido glutámico, y para que contenga unaasparagina en la posición 552 de residuo de aminoácido, y (b) una cápside de hu48 que tiene la secuencia SEQ IDNúm. 50 modificada para que contenga una serina en la posición 277 de residuo de aminoácido, la cual es de formanativa una glicina, y para que contenga una lisina en la posición 322 de residuo de aminoácido, la cual es de formanativa un ácido glutámico.

Método para incrementar la funcionalidad de un vector de AAV.

Antecedentes de la invención Un virus adeno-asociado (AAV) , un miembro de la familia Parvovirus, es un pequeño virus icosaédrico, sin envoltura, con genomas de ADN lineales de cadena simple de 4, 7 kilobases (kb) a 6 kb. El AAV está asignado al género, Dependovirus, debido a que el virus fue descubierto como contaminante en poblaciones de adenovirus purificadas. El ciclo vital del AAV incluye una fase latente en la que los genomas de AAV, tras la infección, están integrados específicamente en el sitio en cromosomas anfitrión y una fase infecciosa en la que, a continuación de una infección cualquiera por adenovirus o virus simplex del herpes, los genomas integrados son posteriormente rescatados, replicados y empaquetados en virus infecciosos. Las propiedades de no patogenicidad, amplia gama de infectividad de anfitrión, incluyendo células no divisoras, e integración cromosómica potencial específica del sitio, hacen que el AAV sea una herramienta atractiva para transferencia de gen.

Los vectores de AAV han sido descritos en cuanto a su uso como vehículos de suministro tanto para moléculas terapéuticas como inmunogénicas. Hasta la fecha, han existido varios AAVs diferentes bien caracterizados, aislados a partir de humanos o de primates no humanos (NHP) .

Recientemente, los investigadores han descrito una gran numero de AAVs de secuencias diferentes [G. Gao et al., Proc. Natil. Acad. Sci. USA, 100 (10) : 6081-6086 (13 de Mayo de 2003) ; US-2003-0138772-A1 (24 de Julio de 2003) ] y caracterizados estos AAVs en diferentes serotipos y clados [G. Gao, et al., J. Virol., 78 (12) : 6381-6388 (Junio 2004) ; Publicación de Patente Internacional núm. WO 2005/033321]. Se ha informado que diferentes AAVs presentan diferentes eficacias de transfección, y también muestran tropismo para diferentes células o tejidos.

Lo que resulta deseable son construcciones basadas en AAV para el suministro de moléculas heterólogas a diferentes tipos de células.

Sumario de la invención La presente invención proporciona, según un aspecto, un vector de virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside de AAVhu48 seleccionada en el grupo consistente en: (a) cápside de hu48 que tiene la secuencia SEQ ID Núm. 50 modificada para que contenga una serina en la posición 277 de residuo de aminoácido, la cual es una glicina de forma nativa, y para que contenga una lisina en la posición 322 de residuo de aminoácido, la cual es de forma nativa un ácido glutámico, y para que contenga una asparagina en la posición 552 de residuo de aminoácido, y (b) una cápside de hu48 que tiene la secuencia SEQ ID Núm. 50 modificada para contener una serina en la posición 277 de residuo de aminoácido, la cual es una glicina de forma nativa, y para contener una lisina en la posición 322 de residuo de aminoácido, la cual es de forma nativa un ácido glutámico.

En realizaciones particulares de la invención, el vector viral porta un transgén que codifica un producto de gen bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen expresión del producto en una célula anfitrión.

La invención se extiende también a composiciones que comprenden vectores de AAV conforme a la invención, en combinación con portadores fisiológicamente compatibles.

Un uso particular de vectores y de composiciones de acuerdo con la invención consiste en suministrar un producto de gen a un sujeto.

Según otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cápside de AAVhu.48 modificada, seleccionada en el grupo consistente en: (a) cápside de hu48 que tiene la secuencia SEQ ID Núm. 50 modificada para contener una serina en la posición 277 de residuo de aminoácido, la cual es una glicina de forma nativa, y para contener una lisina en la posición 322 de residuo de aminoácido, la cual es de forma nativa un ácido glutámico, y para contener una asparagina en la posición 552 de residuo de aminoácido, y (b) cápside de hu48 que tiene la secuencia SEQ ID Núm. 50 modificada para que contenga una serina en la posición 277 de residuo de aminoácido, la cual es de forma nativa una glicina y para que contenga una lisina en la posición 322 de residuo de aminoácido, la cual es de forma nativa un ácido glutámico.

En una realización particular, la molécula de ácido nucleico es un plásmido.

Otros aspectos y ventajas de la invención resultarán fácilmente evidentes a partir de la descripción detalladla que sigue de la invención.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 es un gráfico que ilustra transducción 293 in vitro de vectores de AAV corregidos en singletón. Las correcciones de singletón están indicadas a continuación del nombre del vector, cuando están presentes, con un

número que indica el número de mutaciones realizadas;

Las Figuras 2A-2C son gráficos lineales que ilustran la titulación de vectores de AAV sobre células 293 en multiplicidades de infección comprendidas en la gama de 101 a 104, con una comparación entre rh.8 dominante y rh.8 corregido en singletón (rh.8R) en la Figura 2A, rh.37 dominante y rh.37 modificado (Figura 2B) , y AAV2 y AAV8 en la Figura 2C. Como control, una titulación similar de eGFP de AAV2 y de AAV2/8 que expresa que el vector está presente. El porcentaje (%) de células positivas de eGFP se ha representado sobre el eje Y, y fue ensayado mediante citometría de flujo.

La Figura 3 es un árbol filogenético de secuencias de AAV, que indica su relación filogenética y clados.

Las Figuras 4A-4K son un alineamiento de secuencias de ácido nucleico de la proteína de cápside (vp1) de AAV2 [SEQ ID Núm. 7], cy. 5 [SEQ ID Núm. 8], rh.10 [SEQ ID Núm. 9], rh.13 [SEQ ID Núm. 10], AAV1 [SEQ ID Núm. 11], AAV3 [SEQ ID Núm. 12], AAV6 [SEQ ID Núm. 13], AAV7 [SEQ ID Núm. 14], AAV8 [SEQ ID Núm. 15], hu. 13 [SEQ ID Núm. 16], hu. 26 [SEQ ID Núm. 17], hu. 37 [SEQ ID Núm. 18], hu. 53 [SEQ ID Núm. 19], rh.39 [SEQ ID Núm. 20], rh.43 [SEQ ID Núm. 21] y rh.46 [SEQ ID Núm. 22];

Las Figuras 5A-5D son un alineamiento de las secuencias de aminoácido de la proteína de cápside (vp1) de AAV2 [SEQ ID Núm. 23], cy.5 [SEQ ID Núm. 24], rh.10 [SEQ ID Núm. 25], rh.13 [SEQ ID Núm. 26], AAV1 [SEQ ID Núm. 27], AAV3 [SEQ ID Núm. 28], AAV6 [SEQ ID Núm. 29], AAV7 [SEQ ID Núm. 30], AAV8 [SEQ ID Núm. 31], hu.13 [SEQ ID Núm. 32], hu.26 [SEQ ID Núm. 33], hu.37 [SEQ ID Núm. 34], hu.53 [SEQ ID Núm. 35], rh.39 [SEQ ID Núm. 36], rh.43 [SEQ ID Núm. 37] y rh.46 [SEQ ID Núm. 38];

Las Figuras 6A-6B son un alineamiento de las secuencias de aminoácido de la proteína de cápside (vp1) de rh.13 [SEQ ID Núm. 26], rh.2 [SEQ ID Núm. 39], rh.8 [SEQ ID Núm. 41], hu.29 [SEQ ID Núm. 42], y rh.64 [SEQ ID Núm. 43].

Descripción detallada de la invención La presente invención ha sido concebida usando el “método de singletón” de la solicitante, la cual tiene como objetivo mejorar el rendimiento de empaquetamiento, la eficacia de transducción y/o la eficiencia de transferencia de gen de un vector de AAV que tiene una cápside de un AAV que contiene uno o más singletones. Este método se describe con mayor detalle en lo que sigue y es también objeto de la solicitud de Patente Europea núm. 06749685.1 (de la cual deriva la presente solicitud por división) .

Según se utiliza a través de la presente memoria y de las reivindicaciones, los términos “comprendiendo” e “incluyendo” incluyen otros componentes, elementos, integrantes, etapas y similares. A la inversa, el término “consistiendo” y sus variantes son excluyentes de otros componentes, elementos, integrantes, etapas y similares.

Método de singletón Según se utiliza en la presente memoria, el término “singletón” se refiere a un aminoácido variable en una posición dada de una secuencia de cápside de AAV seleccionada (es decir, parental) . La presencia de un aminoácido variable se determina mediante alineamiento de la secuencia de la cápside de AAV parental con una librería de secuencias funcionales de cápside de AAV. Las secuencias son analizadas a continuación para determinar la presencia de cualesquiera secuencias variables de aminoácido en la cápside de AAV parental donde las secuencias del AAV en la librería de AAVs funcionales tienen una conservación completa. La secuencia de AAV parental es alterada a continuación para cambiar el singletón al aminoácido conservado identificado en esa posición en las secuencias de cápside de AAV funcionales. Una secuencia de AAV parental puede tener de 1 a 6, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3, ó 2 singletones. Una secuencia de... [Seguir leyendo]

1. Un vector de virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside AAVhu48 seleccionada en el grupo consistente en: (a) cápside de hu48 que tiene la secuencia SEQ ID Núm. 50 modificada para que contenga una serina en la 5 posición 277 de residuo de aminoácido, que es de forma nativa una glicina, y para que contenga una lisina en la posición 322 de residuo de aminoácido, que es de forma nativa un ácido glutámico, y para que contenga una asparagina en la posición 552 de residuo de aminoácido, y (b) una cápside de hu48 que tiene la secuencia SEQ ID Núm. 50 modificada para que contenga una serina en la posición 277 de residuo de aminoácido, la cual es de forma nativa una glicina, y para que contenga una lisina en la posición 322 de residuo de aminoácido, la cual es de forma nativa un ácido glutámico.

2. El vector de AAV conforme a la reivindicación 1, en el que la cápside es una cápside de hu48 que tiene la secuencia SEQ ID Núm. 50 modificada para que contenga: (a) una serina en la posición 277 de residuo de aminoácido, la cual es de forma nativa una glicina, y para que contenga una lisina en la posición 322 de residuo de aminoácido, la cual es de forma nativa un ácido glutámico, y para que contenga una asparagina en la posición 552

de residuo de aminoácido.

3. El vector viral conforme a la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho vector viral porta un transgén que codifica un producto de gen bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen expresión del producto en una célula anfitrión.

4. Una composición que comprende un vector de AAV conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y un 20 portador fisiológicamente compatible.

5. Un vector de AAV conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una composición conforme a la reivindicación 4, para su uso en el suministro de un producto de gen a un sujeto.

6. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cápside AAVhu48 modificada seleccionada en el grupo consistente en: (a) cápside de hu48 que tiene la secuencia SEQ ID 25 Núm. 50 modificada para que contenga una serina en la posición 277 de residuo de aminoácido, la cual es de forma nativa una glicina, y para que contenga una lisina en la posición 322 de residuo de aminoácido, la cual es de forma nativa un ácido glutámico, y para que contenga una asparagina en la posición 552 de residuo de aminoácido, y (b) una cápside de hu48 que tiene la secuencia SEQ ID Núm. 50 modificada para que contenga una serina en la posición 277 de residuo de aminoácido, la cual es de forma nativa una glicina, y para que contenga una lisina en la posición 322 de residuo de aminoácido, la cual es de forma nativa un ácido glutámico.

7. La molécula de ácido nucleico conforme a la reivindicación 6, en la que la AAVhu48 modificada es (a) .

8. La molécula de ácido nucleico conforme a la reivindicación 6, la cual es un plásmido.