Método para el análisis de procianidina.

Un método para cuantificar procianidina (un nombre genérico para una mezcla de n-meros de catequina:

n ≥ 1) yflavan-3-oles contenidos en un producto de té, alimentos y/o bebidas, que consiste en las siguientes etapas:

a) pretratar el producto de té, los alimentos y/o las bebidas usando una columna de una resina basada endextrano o basada en polímero vinílico para eliminar contaminantes que afectan al análisis de la procianidinay de los flavan-3-oles, donde dichos contaminantes son seleccionados entre metilxantinas, fenilpropanoides,flavonas, flavonoles y compuestos glicosilados de los mismos, y donde la etapa de pretratamiento consiste enequilibrar la columna con agua, cargar la muestra en la columna, eluir los contaminantes con agua y/o etanoldel 0% al 40% y recoger luego la procianidina y los flavan-3-oles con etanol al 60% o más; y

b) efectuar una cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) con una columna de fase invertida paraseparar y cuantificar la procianidina y los flavan-3-oles en la solución tratada para eliminar los contaminantesdurante la etapa de pretratamiento a).

Método para el análisis de procianidina Campo de la invención La presente invención se relaciona con un método para cuantificar procianidina y flavan-3-oles contenidos en un producto de té, alimentos y/o bebidas.

Antecedentes de la invención En términos de eficacia, se considera que la proantocianidina (OPC) está entre los principios activos relacionados con la "Paradoja Francesa", ya que la OPC está también contenida en los vinos (1995, Clin. Chim. Acta., 235, 207219) . Se sabe que la OPC tiene diversas acciones y efectos, tales como una acción antioxidante, una acción mejoradora de la circulación periférica, un efecto mejorador del flujo sanguíneo y un efecto mejorador de la función hepática (2004, Japan Food Science, 403, edición de Enero, 40-45) , así como un efecto inhibidor de la agregación plaquetaria (JP 2003-527418 A) .

Las técnicas previamente conocidas para el análisis de la proantocianidina incluyen la HPLC de fase invertida utilizando un cromatógrafo líquido de alto rendimiento-espectrómetro de masas (LC-MS) (2003, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67 (5) , 1140-1142) y la HPLC en fase normal por LC-MS utilizando una elución en gradiente (2003, J. Agric. Food Chem., 51, 7513-7521) . También se conocen técnicas para el análisis de la procianidina utilizando una columna de pretratamiento antes de efectuar la HPLC de fase invertida (2004, Analyt. Chim. Acta, 522 (1) , 105-112; 1999, J. Chromatogr. A, 830 (2) , 301-309) . Sin embargo, en cualquiera de estas técnicas de análisis, la procianidina en forma de mezcla con otros ingredientes de té, alimentos o suplementos ha sido difícil de separar de dichos picos contaminantes; así, estas técnicas no pueden conseguir una cuantificación precisa. Más aún, existe un número muy grande de estereoisómeros para la proantocianidina debido al estereoisomerismo de sus constituyentes, los flavan3-oles, por lo que ha habido una limitación en cuanto a compuestos disponibles como patrones. Por esta razón, ha sido imposible el análisis cuantitativo, excepto para algunos compuestos conocidos.

Resumen de la invención Existe una fuerte demanda en cuanto al desarrollo de un nuevo método de análisis que permita la cuantificación precisa de procianidina (un nombre genérico para una mezcla de n-meros de catequina; n ! 1) y flavan-3-oles en productos de té, alimentos y/o bebidas, que contienen procianidina y flavan-3-oles, sin recibir interferencia alguna por parte de contaminantes. De este modo, la presente invención proporciona un nuevo método para cuantificar procianidina y flavan-3-oles contenidos en productos de té, alimentos y/o bebidas.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 muestra las fórmulas estructurales de la procianidina B1 y de la procianidina B3.

La Figura 2 muestra un cromatograma de HPLC de la fracción eluida con EtOH al 70% en la etapa de pretratamiento. Las condiciones de análisis son las siguientes: sistema de HPLC: Shimadzu LC-2010HT (Shimadzu Corporation, Japón) ; columna: Capcellpak C-18 AQ (6 mm x 150 mm, Shiseido Co., Ltd., Japón) ; Fase móvil: eluyente A: TFA al 0, 05%/agua, eluyente B: TFA al 0, 05%/CH3CN al 90%/agua; velocidad de flujo: 1, 2 ml/minuto; gradiente: 10% B ∀ 10% B (10 minutos) y 10% B ∀ 35% B (10 minutos) ; temperatura de la columna: 40°C; detección: A225 nm. En estas condiciones, la procianidina B1 eluyó a los 10, 7 minutos, la procianidina B3 a los 12, 6 minutos, la catequina a los 14, 0 minutos, la epicatequina a los 17, 6 minutos, la galocatequina a los 6, 4 minutos, la epigalocatequina a los 11, 1 minutos, el epigalocatequin-3-O-galato a los 18, 2 minutos y el galocatequin-3-O-galato a los 19, 1 minutos, respectivamente.

Descripción detallada de la invención Como resultado de diversos estudios realizados para alcanzar el objetivo anterior, los inventores de la presente invención han visto que la procianidina y los flavan-3-oles contenidos en productos de té y/o alimentos y bebidas pueden ser cuantificados sin resultar afectados por contaminantes cuando (a) se pretrata una muestra de ensayo con una resina basada en dextrano o basada en polímero vinílico para eliminar los contaminantes (v.g., cafeína) que no pueden ser separados usando resinas adsorbentes hidrofóbicas o similares, y (b) se efectúa una cromatografía líquida de alto rendimiento para separar y cuantificar la procianidina y los flavan-3-oles fraccionados.

Así, la presente invención proporciona un método para cuantificar procianidina y flavan-3-oles contenidos en un producto de té, alimentos y/o bebidas según la reivindicación 1.

Substancias que se han de cuantificar mediante el método de la presente invención La substancia que se ha de cuantificar mediante el método de la presente invención puede ser cualquiera entre procianidina (un nombre genérico para una mezcla de n-meros de catequina; n ! 1) y flavan-3-oles. Entre los flavan3-oles que se han de cuantificar mediante el método de la presente invención, se incluyen, aunque sin limitación, catequina, epicatequina, galocatequina, epigalocatequina, catequin-3-O-galato, epicatequin-3-O-galato, galocatequin-3-O-galato y epigalocatequin-3-O-galato. La procianidina que se ha de cuantificar mediante el método de la presente invención incluye, aunque sin limitación, las procianidinas B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 y B8. La substancia que se ha de cuantificar mediante el método de la presente invención puede ser preferiblemente la procianidina B1 (PB1) y/o la procianidina B3 (PB3) , y más preferiblemente la PB1.

Muestras de ensayo La muestra de ensayo que se ha de analizar mediante el método de la presente invención puede ser cualquier muestra que se espere que contenga procianidina y/o flavan-3-oles seleccionada entre el grupo consistente en un producto de té, alimentos y/o bebidas (v.g., pepitas de uva, tamarindo, manzana, corteza, hojas de té, cacao y/o productos tratados (v.g., extractos) de los mismos) . Una muestra de ensayo preferida que se ha de analizar mediante el método de la presente invención es una bebida de té que contiene procianidina, y más preferiblemente una bebida de té que contiene un extracto de corteza de pino.

Etapa de pretratamiento En el análisis de la procianidina y de los flavan-3-oles en una muestra de ensayo utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento, como contaminantes que alteran el análisis se incluyen metilxantinas (v.g., cafeína, teobromina) , fenilpropanoides (v.g., ácido cofeico, ácido cumárico, ácido ferúlico) , flavonas, flavonoles y compuestos glicosilados de los mismos.

Cuando se usa un soporte de fase invertida (v.g., C8 o C18) en un intento de separar la procianidina y los flavan-3ºles de estos contaminantes, estas substancias se adsorben todas sobre la resina y por ello se eluyen al mismo tiempo. Por esta razón es imposible separarlas entre sí o, incluso cuando es posible, requieren un período muy largo de tiempo para su análisis. Después de una serie de estudios sobre las condiciones que permiten la separación de la procianidina y de los flavan-3-oles de estos contaminantes, los inventores de la presente invención han logrado separar la procianidina y los flavan-3-oles de estos contaminantes en una columna de filtración por gel con un eluyente que contiene un solvente orgánico polar. Así, en el método de la presente invención, la separación en columna permite la fraccionación de procianidina y flavan-3-oles con respecto a los contaminantes anteriores cuando se usa como pretratamiento.

Como resinas para columnas disponibles para uso en el pretratamiento, se incluyen resinas basadas en dextrano (v.g., Sephadex LH-20 (Amersham Biosciences) ) y resinas de filtración por gel basadas en polímeros vinílicos hidrofílicos (v.g., TOYOPEARL HW40 (Tosoh Corporation, Japón) y TOYOPEARL HW-50 (Tosoh Corporation, Japón) ) . Estas resinas permiten la fraccionación entre contaminantes y procianidina/flavan-3-oles.

En la etapa de pretratamiento, se eluyen los contaminantes con agua y/o etanol del 0% al 40%, y luego se recogen la procianidina y los flavan-3-oles con etanol al 60% o más. Por ejemplo, después de cargar una muestra de ensayo en una columna, se puede eluir la cafeína como contaminante con etanol del 0% al 20%, mientras que se pueden eluir los fenilpropanoides, las flavonas y los flavonoles con etanol del 20% al 40%, seguido finalmente por la elución de la procianidina y de los flavan-3-oles con etanol del 60% al 80%, para obtener la procianidina y los flavan-3-oles deseados sin que contengan contaminante alguno.

Etapa de separación y cuantificación por cromatografía líquida de alto rendimiento A continuación, se analiza la solución tratada para eliminar los contaminantes en la etapa de pretratamiento por cromatografía... [Seguir leyendo]

1. Un método para cuantificar procianidina (un nombre genérico para una mezcla de n-meros de catequina: n ! 1) y flavan-3-oles contenidos en un producto de té, alimentos y/o bebidas, que consiste en las siguientes etapas:

a) pretratar el producto de té, los alimentos y/o las bebidas usando una columna de una resina basada en dextrano o basada en polímero vinílico para eliminar contaminantes que afectan al análisis de la procianidina y de los flavan-3-oles, donde dichos contaminantes son seleccionados entre metilxantinas, fenilpropanoides, flavonas, flavonoles y compuestos glicosilados de los mismos, y donde la etapa de pretratamiento consiste en equilibrar la columna con agua, cargar la muestra en la columna, eluir los contaminantes con agua y/o etanol del 0% al 40% y recoger luego la procianidina y los flavan-3-oles con etanol al 60% o más; y b) efectuar una cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) con una columna de fase invertida para separar y cuantificar la procianidina y los flavan-3-oles en la solución tratada para eliminar los contaminantes durante la etapa de pretratamiento a) .

2. El método según la reivindicación 1, donde los contaminantes son una o más substancias seleccionadas entre el grupo consistente en cafeína, teobromina, fenilpropanoides, flavonoles y compuestos glicosilados de fenilpropanoides y flavonoles.

3. El método según la reivindicación 1 ó 2, donde el producto de té es una bebida de té que contiene procianidina.

4. El método según la reivindicación 1 ó 2, donde el producto de té es una bebida de té que contiene un extracto de corteza de pino.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la columna usada en la etapa de pretratamiento es una columna de una resina basada en dextrano.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la columna de fase invertida es una columna empaquetada con un material de empaquetamiento seleccionado entre el grupo consistente en un soporte de gel de 30 sílice que tiene grupos octadecilo químicamente unidos al mismo (ODS) , un soporte de gel de sílice que tiene grupos butilo químicamente unidos al mismo (C4) , un soporte de gel de sílice que tiene grupos octilo químicamente unidos al mismo (C8) , un soporte de gel de sílice que tiene grupos fenilo químicamente unidos al mismo (Ph) , un soporte de gel de sílice que tiene cadenas de alquilo C30 químicamente unidas al mismo (C30) , un soporte de polímero sintético que tiene grupos octadecilo unidos al mismo (ODP) , un soporte de polímero sintético de fase invertida y un soporte de fase invertida funcionalizado con amida.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la fase móvil usada en la etapa b) para la separación por cromatografía líquida de alto rendimiento es acetonitrilo y/o agua, cada uno de los cuales puede contener o no TFA (ácido trifluoroacético) .

8. El método según la reivindicación 7, donde la fase móvil es un gradiente de acetonitrilo y agua, cada uno de los cuales puede contener o no TFA (ácido trifluoroacético) .

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la fase móvil usada en la etapa b) para la

separación por cromatografía líquida de alto rendimiento consiste en un solvente seleccionado entre el grupo consistente en metanol, etanol, acetonitrilo, acetona y un solvente mixto de éstos.

10. El método según la reivindicación 9, donde la fase móvil utilizada en la etapa b) para la separación por

cromatografía líquida de alto rendimiento incluye además TFA (ácido trifluoroacético) , ácido fórmico, ácido acético, 50 TCA (ácido tricloroacético) o ácido perclórico.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la procianidina que se ha de cuantificar es procianidina B1 (PB1) .

12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que se combina además con un espectrómetro de masas con objeto de cuantificar sólo dímeros de procianidina.